Was Tm bedeutet
Die Schmelztemperatur (Tm) ist die Temperatur, bei der die Hälfte des Primers an sein Ziel gebunden und die andere Hälfte frei ist. Der Annealing-Schritt der PCR liegt etwas darunter, damit die Primer fest binden, aber nur an der richtigen Stelle.
Drei Berechnungswege
- Die Wallace-Regel für Primer unter etwa 14 Basen: Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). Schnell, aber sie ignoriert die Reihenfolge der Basen und den Puffer.
- Die GC-Formel für längere Primer: Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) ÷ Länge. Ein 20-mer mit 10 G oder C ergibt 64,9 + 41 × (10 − 16,4) ÷ 20 = 51,8 °C.
- Nearest-Neighbor-Thermodynamik, die genaueste Methode: Sie addiert die Stapelenergie jedes Paars benachbarter Basen und korrigiert dann für Primerkonzentration und Salz im Ansatz.
Warum der Puffer zählt
Kationen schirmen die negative Ladung des DNA-Rückgrats ab; mehr Salz bedeutet also eine höhere Tm. Magnesium wirkt viel stärker als Natrium, und dNTPs binden einen Teil davon. Derselbe Primer kann sich zwischen Rechnern mit unterschiedlichen Pufferannahmen um 5 °C oder mehr unterscheiden. Gib deshalb die Natrium-, Magnesium- und dNTP-Konzentrationen deines eigenen Ansatzes ein.
Die Annealing-Temperatur wählen
Starte etwa 5 °C unter der niedrigeren Tm des Paars. Siehst du kein Produkt, senke sie; siehst du zusätzliche Banden, erhöhe sie. Eine Gradienten-PCR testet einen Bereich in einem Lauf. Manche High-Fidelity-Polymerasen bringen eigene Herstellerregeln für ihren Puffer mit, die einen anderen Startwert ergeben können.
Faustregeln fürs Primerdesign
- 18 bis 25 Basen lang, mit 40 % bis 60 % GC.
- Die Tm der beiden Primer höchstens etwa 5 °C auseinander.
- Ein G oder C am 3'-Ende, aber höchstens 3 G oder C in den letzten 5 Basen.
- Keine Folgen von 4 oder mehr gleichen Basen und keine Abschnitte, die mit sich selbst oder dem anderen Primer paaren.
Rechner
Der Primer-Tm-Rechner nutzt Nearest-Neighbor-Thermodynamik mit deinen Salz-, Magnesium- und Primerkonzentrationen und schlägt eine Annealing-Temperatur vor. PCR-Primer-Statistik vergleicht alle drei Methoden und warnt vor Haarnadeln, Selbstdimeren und Basenfolgen.