Apa arti Tm
Suhu leleh (Tm) adalah suhu saat separuh primer menempel pada targetnya dan separuhnya lepas. Tahap annealing PCR diatur sedikit di bawahnya, agar primer menempel kuat tetapi hanya di tempat yang tepat.
Tiga cara menghitungnya
- Aturan Wallace, untuk primer di bawah sekitar 14 basa: Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). Cepat, tetapi mengabaikan urutan basa dan buffer.
- Rumus GC, untuk primer yang lebih panjang: Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) ÷ panjang. Primer 20 basa dengan 10 G atau C memberi 64,9 + 41 × (10 − 16,4) ÷ 20 = 51,8 °C.
- Termodinamika nearest-neighbor, yang paling akurat: menjumlahkan energi tumpukan setiap pasangan basa bertetangga, lalu mengoreksi untuk konsentrasi primer dan garam dalam reaksi.
Mengapa buffer penting
Kation menetralkan muatan negatif tulang punggung DNA, jadi semakin banyak garam, semakin tinggi Tm. Magnesium berpengaruh jauh lebih besar daripada natrium, dan dNTP mengikat sebagiannya. Primer yang sama bisa berbeda 5 °C atau lebih antara kalkulator yang mengasumsikan buffer berbeda, jadi isi konsentrasi natrium, magnesium, dan dNTP campuran Anda sendiri.
Memilih suhu annealing
Mulailah sekitar 5 °C di bawah Tm yang lebih rendah dari pasangan primer. Jika tidak ada produk, turunkan; jika muncul pita tambahan, naikkan. PCR gradien menguji satu rentang dalam sekali jalan. Beberapa polimerase high-fidelity punya aturan sendiri dari produsennya untuk buffer mereka, yang bisa memberi titik awal berbeda.
Aturan praktis desain primer
- Panjang 18 sampai 25 basa, dengan GC 40% sampai 60%.
- Tm kedua primer berselisih sekitar 5 °C atau kurang.
- G atau C di ujung 3', tetapi tidak lebih dari 3 G atau C di 5 basa terakhir.
- Tanpa deretan 4 basa sama atau lebih, dan tanpa bagian yang berpasangan dengan dirinya sendiri atau dengan primer lainnya.
Kalkulator
Kalkulator Tm Primer memakai termodinamika nearest-neighbor dengan konsentrasi garam, magnesium, dan primer Anda, lalu menyarankan suhu annealing. Statistik primer PCR membandingkan ketiga metode dan memperingatkan hairpin, self-dimer, dan deretan basa.