Cara Mengukur Konsentrasi Protein pada A280

Mengapa protein menyerap pada 280 nm

Triptofan dan tirosin menyerap sinar ultraviolet pada 280 nm, dan ikatan disulfida menambah sedikit. Karena jumlahnya berbeda pada tiap protein, setiap protein punya koefisien ekstingsi sendiri, dan hasil A280 hanya seakurat koefisien yang dipakai.

Rumusnya

Dari hukum Beer-Lambert, konsentrasi (M) = A280 ÷ (ε × panjang lintasan), dengan ε adalah koefisien ekstingsi molar dalam M⁻¹ cm⁻¹. Kalikan dengan berat molekul untuk mendapat mg/mL. Jalan pintasnya adalah Abs 0,1%, absorbansi larutan 1 mg/mL, yaitu ε ÷ berat molekul: mg/mL = A280 ÷ Abs 0,1%.

Koefisien ekstingsi dari sekuens

Metode Pace dan rekan (1995) menghitung residu yang menyerap:

ε = 5.500 × Trp + 1.490 × Tyr + 125 × sistin

Sistin adalah sepasang sistein yang dihubungkan ikatan disulfida; hilangkan suku ini untuk protein tereduksi.

Contoh perhitungan

Bovine serum albumin memiliki ε = 43.824 M⁻¹ cm⁻¹ dan berat molekul 66.430 Da, jadi Abs 0,1%-nya 43.824 ÷ 66.430 = 0,66. Pembacaan 0,33 dalam kuvet 1 cm berarti 0,33 ÷ 0,66 = 0,5 mg/mL, atau 7,5 µM.

Jebakan

• Buat blanko dengan buffer yang sama dengan buffer protein; imidazol, deterjen, dan beberapa reduktor menyerap pada 280 nm.
• Kontaminasi asam nukleat menaikkan A280. Protein murni memiliki rasio A260/A280 sekitar 0,6; nilai mendekati 1 atau lebih menandakan DNA atau RNA.
• Agregat menghamburkan cahaya dan membuat hasil terlalu tinggi. Sentrifus atau saring sampel yang keruh.
• Jaga pembacaan antara sekitar 0,1 dan 1,0, encerkan bila perlu.
• Protein tanpa triptofan dan tirosin tidak bisa diukur dengan cara ini; pakai uji Bradford atau BCA.

Kalkulator

Kalkulator konsentrasi protein menghitung koefisien ekstingsi dari sekuens yang ditempel, atau memakai koefisien yang diketahui atau Abs 0,1%, lalu memberi mg/mL dan µM. Kalkulator hukum Beer-Lambert menyelesaikan persamaan umumnya, dan Berat molekul protein memberi massa dari sekuens.