Mengapa memakai rasio molar
Ligasi bergantung pada jumlah ujung DNA, bukan massanya. Insert kecil punya jauh lebih banyak molekul per ng daripada vektor besar, jadi massa yang sama akan menghasilkan jumlah molekul yang sangat berbeda. Karena itu protokol memberi rasio molar insert terhadap vektor, paling sering 3:1.
Rumusnya
insert (ng) = vektor (ng) × panjang insert ÷ panjang vektor × rasio
Dengan 50 ng vektor 3.000 bp dan insert 1.000 bp pada 3:1: 50 × 1.000 ÷ 3.000 × 3 = 50 ng insert.
Tips
- Coba 1:1, 3:1, dan 5:1 bila percobaan pertama menghasilkan sedikit koloni.
- Insert yang sangat pendek, seperti oligo yang di-anneal, sering butuh rasio lebih tinggi.
- Sertakan ligasi vektor saja sebagai kontrol latar belakang dari vektor yang tidak terpotong atau menyambung sendiri.
- Ukur konsentrasi setelah purifikasi, bukan sebelumnya.
Kalkulator
Kalkulator Ligasi memberikan ng insert untuk rasio berapa pun dan, dengan konsentrasi insert, volume yang harus dipipet. Ukur konsentrasi itu dengan Kalkulator Konsentrasi DNA.
Contoh dengan volume
Dari contoh di atas, Anda butuh 50 ng vektor dan 50 ng insert. Jika vektor berkonsentrasi 50 ng/µL dan insert 25 ng/µL:
- Vektor: 50 ÷ 50 = 1 µL.
- Insert: 50 ÷ 25 = 2 µL.
- Buffer ligase 10×: 2 µL. T4 DNA ligase: 1 µL.
- Air hingga 20 µL: 14 µL.
Memeriksanya dalam mol
Satu pasang basa DNA untai ganda beratnya sekitar 650 g/mol, jadi pmol = ng × 1.000 ÷ (bp × 650). Vektornya 50.000 ÷ (3.000 × 650) ≈ 0,026 pmol dan insertnya 50.000 ÷ (1.000 × 650) ≈ 0,077 pmol, tiga kali lipat.
Koloni sedikit atau tidak ada
- ATP dalam buffer ligase terurai setiap kali dibekukan dan dicairkan. Simpan buffer dalam alikuot kecil.
- Ujung tumpul jauh lebih sulit diligasi daripada ujung lengket; gunakan lebih banyak ligase dan inkubasi lebih lama.
- Vektor yang sudah didefosforilasi memerlukan insert yang masih memiliki fosfat 5′; produk PCR dengan primer biasa tidak memilikinya.