Mengapa memakai rasio molar
Ligasi bergantung pada jumlah ujung DNA, bukan massanya. Insert kecil punya jauh lebih banyak molekul per ng daripada vektor besar, jadi massa yang sama akan menghasilkan jumlah molekul yang sangat berbeda. Karena itu protokol memberi rasio molar insert terhadap vektor, paling sering 3:1.
Rumusnya
insert (ng) = vektor (ng) × panjang insert ÷ panjang vektor × rasio
Dengan 50 ng vektor 3.000 bp dan insert 1.000 bp pada 3:1: 50 × 1.000 ÷ 3.000 × 3 = 50 ng insert.
Tips
- Coba 1:1, 3:1, dan 5:1 bila percobaan pertama menghasilkan sedikit koloni.
- Insert yang sangat pendek, seperti oligo yang di-anneal, sering butuh rasio lebih tinggi.
- Sertakan ligasi vektor saja sebagai kontrol latar belakang dari vektor yang tidak terpotong atau menyambung sendiri.
- Ukur konsentrasi setelah purifikasi, bukan sebelumnya.
Kalkulator
Kalkulator Ligasi memberikan ng insert untuk rasio berapa pun dan, dengan konsentrasi insert, volume yang harus dipipet. Ukur konsentrasi itu dengan Kalkulator Konsentrasi DNA.