Cara Mendesain Primer qPCR

Apa bedanya primer qPCR dengan primer PCR

qPCR mengukur seberapa cepat produk menumpuk, siklus demi siklus, jadi primer harus menyalin targetnya dengan efisiensi mendekati 100% dan hanya menghasilkan satu produk. Karena itu amplikon harus pendek dan aturannya lebih ketat daripada PCR untuk kloning, yang cukup asal pita yang benar muncul. Aturan umumnya ada di Cara Mendesain Primer PCR; berikut aturan yang berubah untuk qPCR.

Aturannya

• Amplikon: sekitar 70 sampai 150 bp. Produk pendek tersalin utuh di setiap siklus, sehingga efisiensi tetap tinggi.
• Panjang primer: 18 sampai 25 basa.
• Tm: sekitar 58 sampai 62 °C, kedua primer berselisih paling banyak 1 sampai 2 °C, dihitung dengan garam dan magnesium master mix Anda.
• Kadar GC: 40% sampai 60%, dengan paling banyak 3 G atau C di 5 basa terakhir ujung 3′.
• Hindari: deretan 4 basa sama atau lebih, terutama G, dan bagian yang berpasangan dengan primer itu sendiri atau dengan primer lainnya. Dimer primer paling berpengaruh pada SYBR Green, yang membuat semua DNA untai ganda berpendar, termasuk dimer.

Probe

Probe hidrolisis (TaqMan) menempel di antara kedua primer dan didesain dengan Tm sekitar 5 sampai 10 °C di atas Tm primer, agar sudah menempel saat primer mulai memanjang. Hindari G di ujung 5′, di sebelah pewarna reporter, karena G di situ meredam fluoresensi.

Mengukur mRNA: lintasi sambungan ekson-ekson

Untuk ekspresi gen dari cDNA, letakkan satu primer melintasi sambungan ekson-ekson, atau letakkan kedua primer di ekson berbeda dengan intron panjang di antaranya. DNA genomik yang tersisa di RNA lalu tidak menghasilkan produk, atau menghasilkan produk yang terlalu panjang untuk teramplifikasi dengan baik. Kontrol tanpa RT, yaitu RNA yang melewati reaksi tanpa reverse transcriptase, menunjukkan apakah masih ada DNA genomik yang lolos.

Periksa primer sebelum memesan

1. Hitung kedua Tm dengan kalkulator Tm primer, memakai magnesium master mix Anda, yang sering 3 mM atau lebih.
2. Cari hairpin, self-dimer, dan ujung 3′ yang terlalu lemah atau terlalu lengket dengan PCR Primer Stats.
3. Tempel templat ke PCR Products untuk memastikan hanya ada satu produk dengan ukuran yang diharapkan, dan cari primer di seluruh genom, misalnya dengan NCBI Primer-BLAST, untuk menyingkirkan target lain.

Periksa di laboratorium

Buat seri pengenceran templat, lima langkah 10 kali atau lebih, lalu plot Ct terhadap log jumlah dengan kalkulator kurva standar. Kemiringannya memberi efisiensi: E = 10^{−1/kemiringan} − 1. Kemiringan −3,32 berarti 100%, dan 90% sampai 110% umumnya diterima. Dengan SYBR Green, kurva leleh dengan satu puncak tajam menandakan satu produk, dan kontrol tanpa templat harus tetap datar. Lalu hitung ekspresi relatif dengan kalkulator ΔΔCt, yang memakai metode Pfaffl jika efisiensi kedua pasang primer berbeda.