Ce qui distingue les amorces de qPCR
Une qPCR mesure la vitesse à laquelle le produit s'accumule, cycle après cycle : les amorces doivent copier leur cible avec une efficacité proche de 100 % et ne donner qu'un seul produit. Cela demande des amplicons courts et des règles plus strictes qu'une PCR de clonage, où n'importe quelle quantité de la bonne bande suffit. Les règles générales sont dans Comment concevoir des amorces de PCR ; voici celles qui changent en qPCR.
Les règles
- Amplicon : environ 70 à 150 pb. Un produit court est copié entièrement à chaque cycle, ce qui garde l'efficacité élevée.
- Longueur des amorces : 18 à 25 bases.
- Tm : environ 58 à 62 °C, les deux amorces à 1 ou 2 °C l'une de l'autre, calculée pour le sel et le magnésium de votre master mix.
- Teneur en GC : 40 % à 60 %, avec au plus 3 G ou C dans les 5 dernières bases de l'extrémité 3′.
- À éviter : les suites de 4 bases identiques ou plus, surtout de G, et les segments qui s'apparient avec l'amorce elle-même ou avec l'autre. Les dimères d'amorces comptent surtout avec le SYBR Green, qui fait briller tout ADN double brin, dimères compris.
Sondes
Une sonde d'hydrolyse (TaqMan) se fixe entre les deux amorces et se conçoit avec une Tm 5 à 10 °C au-dessus de la leur, pour être déjà fixée quand les amorces commencent à s'allonger. Évitez un G à son extrémité 5′, à côté du fluorophore, car un G à cet endroit éteint la fluorescence.
Mesurer un ARNm : chevaucher une jonction exon-exon
Pour l'expression des gènes à partir d'ADNc, placez une amorce à cheval sur une jonction exon-exon, ou les deux amorces dans des exons différents séparés par un long intron. L'ADN génomique resté dans l'ARN ne donne alors pas de produit, ou un produit trop long pour être bien amplifié. Un contrôle sans RT, de l'ARN passé dans la réaction sans transcriptase inverse, montre si de l'ADN génomique passe encore.
Vérifier les amorces avant de les commander
- Calculez les deux Tm avec le calculateur de Tm d'amorces, avec le magnésium de votre master mix, souvent 3 mM ou plus.
- Recherchez les épingles à cheveux, les autodimères et une extrémité 3′ trop faible ou trop collante avec PCR Primer Stats.
- Collez la matrice dans PCR Products pour confirmer un seul produit de la taille attendue, et cherchez les amorces dans tout le génome, par exemple avec NCBI Primer-BLAST, pour écarter d'autres cibles.
Les vérifier au laboratoire
Faites une gamme de dilutions de la matrice, cinq paliers ou plus de 10 fois, et tracez le Ct en fonction du logarithme de la quantité avec le calculateur de courbe étalon. La pente donne l'efficacité : E = 10−1/pente − 1. Une pente de −3,32 correspond à 100 %, et 90 % à 110 % est généralement accepté. Avec le SYBR Green, une courbe de fusion à un seul pic net indique un produit unique, et le contrôle sans matrice doit rester plat. Calculez ensuite l'expression relative avec le calculateur ΔΔCt, qui utilise la méthode de Pfaffl quand les efficacités des deux couples d'amorces diffèrent.