La densité d'ensemencement se rapporte à la surface
Les cellules adhérentes sont en général ensemencées à une densité en cellules par cm² de surface de culture, pour que la même densité donne la même couverture dans tout récipient. Surfaces courantes :
- Plaque 96 puits : 0,32 cm² par puits
- Plaque 24 puits : 1,9 cm² par puits
- Plaque 12 puits : 3,8 cm² par puits
- Plaque 6 puits : 9,5 cm² par puits
- Flasques T25, T75 et T175 : 25, 75 et 175 cm²
Vérifiez la fiche du fabricant ; les surfaces varient un peu selon les marques.
Trois étapes
- Cellules par récipient = densité × surface. À 20 000 cellules/cm² en plaque 6 puits : 20 000 × 9,5 = 190 000 cellules par puits.
- Cellules au total = cellules par récipient × nombre de récipients, plus environ 10 % de pertes au pipetage. Six puits : 190 000 × 6 × 1,1 = 1 254 000 cellules.
- Volume de suspension = cellules au total ÷ votre comptage en cellules/mL. Avec 1 000 000 cellules/mL à la cellule de Malassez ou de Neubauer : 1,25 mL, complétés avec du milieu jusqu'au volume total voulu (6 × 2 mL = 12 mL, plus 10 %).
Choisir la densité
La densité dépend de la lignée et du moment où vous voulez utiliser les cellules. Pour atteindre une confluence donnée un jour précis, remontez le temps avec le temps de doublement : une fois remises du passage, en général après environ un jour, les cellules doublent une fois par temps de doublement. Une lignée qui double toutes les 24 heures ensemencée à 25 % de couverture est presque confluente au bout de deux à trois jours. Les fiches des fournisseurs et les protocoles publiés donnent une densité de départ pour la plupart des lignées.
Une couche régulière
Mélangez la suspension juste avant chaque transfert, car les cellules sédimentent en une ou deux minutes. Après l'ensemencement, déplacez les plaques en croix (avant-arrière, gauche-droite) plutôt qu'en rond, ce qui pousse les cellules vers le bord des puits, et laissez-les se poser 15 à 30 minutes avant de les mettre à l'incubateur.
Outils
Comptez les cellules avec le Calculateur d'hémocytomètre, puis saisissez le comptage et la densité dans le Calculateur d'ensemencement cellulaire pour obtenir les volumes de suspension et de milieu pour plaques et flasques. Le Calculateur de temps de doublement le calcule à partir de deux comptages.