A densidade de semeadura é por área
Células aderentes costumam ser semeadas com uma densidade em células por cm² de área de cultivo, para que a mesma densidade dê a mesma cobertura em qualquer recipiente. Áreas típicas:
- Placa de 96 poços: 0,32 cm² por poço
- Placa de 24 poços: 1,9 cm² por poço
- Placa de 12 poços: 3,8 cm² por poço
- Placa de 6 poços: 9,5 cm² por poço
- Frascos T25, T75 e T175: 25, 75 e 175 cm²
Confira a ficha do fabricante; as áreas variam um pouco entre marcas.
Três passos
- Células por recipiente = densidade × área. A 20.000 células/cm² numa placa de 6 poços: 20.000 × 9,5 = 190.000 células por poço.
- Total de células = células por recipiente × número de recipientes, mais uns 10% de perda na pipetagem. Seis poços: 190.000 × 6 × 1,1 = 1.254.000 células.
- Volume de suspensão = total de células ÷ sua contagem em células/mL. Com 1.000.000 células/mL na câmara de Neubauer: 1,25 mL, completados com meio até o volume total necessário (6 × 2 mL = 12 mL, mais 10%).
Escolhendo a densidade
A densidade depende da linhagem e de quando você quer usar as células. Para chegar a uma confluência num dia certo, calcule de trás para frente com o tempo de duplicação: as células dobram uma vez por tempo de duplicação depois de se recuperarem da passagem, em geral após cerca de um dia. Uma linhagem que dobra a cada 24 horas semeada a 25% de cobertura fica quase confluente em dois a três dias. Fichas do fornecedor e protocolos publicados dão uma densidade inicial para a maioria das linhagens.
Uma camada uniforme
Misture a suspensão logo antes de cada transferência, porque as células assentam em um ou dois minutos. Depois de semear, mova as placas em cruz (frente e trás, esquerda e direita) em vez de girar, o que empurra as células para a borda do poço, e deixe assentar de 15 a 30 minutos antes de levar à estufa.
Ferramentas
Conte as células com a Calculadora de hemocitômetro e depois informe a contagem e a densidade na Calculadora de semeadura de células para obter os volumes de suspensão e de meio para placas e frascos. A Calculadora de tempo de duplicação calcula esse tempo a partir de duas contagens.