Como calcular a variação de expressão em qPCR com ΔΔCt

O que você precisa

Os Ct de um gene-alvo e de um gene de referência (um gene constitutivo como GAPDH ou ACTB, cuja expressão não muda com o tratamento), medidos numa amostra tratada e numa amostra controle.

Os três passos

Normalize cada amostra pelo gene de referência: ΔCt = Ct alvo − Ct referência.
Compare tratada com controle: ΔΔCt = ΔCt tratada − ΔCt controle.
Converta em variação: variação = 2^−ΔΔCt.

Um exemplo resolvido

Tratada: Ct alvo 22,1, Ct referência 18,0, então ΔCt = 4,1. Controle: Ct alvo 24,5, Ct referência 18,0, então ΔCt = 6,5.

ΔΔCt = 4,1 − 6,5 = −2,4, e a variação = 2^2,4 = 5,3. O alvo é expresso cerca de 5,3 vezes mais na amostra tratada. Uma variação menor que 1 indica menos expressão; 0,5 é a metade.

Quando 2^-ΔΔCt não basta

O método supõe que os dois pares de primers têm eficiência próxima de 100%, dobrando o produto a cada ciclo. Confira com uma curva-padrão; o normal é de 90% a 110%. Se as eficiências forem diferentes, use o método de Pfaffl, que inclui a eficiência de cada gene: razão = E_alvo^{ΔCt alvo} ÷ E_referência^{ΔCt referência}, em que cada ΔCt é controle menos tratada e E = 1 + eficiência.

Réplicas e estatística

Faça a média das réplicas técnicas (poços da mesma amostra) antes de calcular o ΔCt.
Faça a estatística com os valores de ΔCt ou ΔΔCt das réplicas biológicas, não com as variações, porque elas não têm distribuição normal.
Informe o log₂ da variação, que é simplesmente −ΔΔCt, quando quiser aumentos e diminuições na mesma escala.

Calculadora

A calculadora ΔΔCt faz a média das réplicas, dá ΔCt, ΔΔCt, a variação e seu log₂, e passa para o método de Pfaffl quando você informa as eficiências dos primers. Para quantificação absoluta com curva-padrão, a calculadora de número de cópias de DNA calcula as cópias de cada padrão.

Ferramentas deste guia

Calculadora ΔΔCt Calculadora de número de cópias de DNA

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