Como ressuspender primers e oligos

A fórmula

Os oligos chegam secos, com a quantidade em nmol no tubo ou na ficha técnica. Para um estoque em µM:

Volume a adicionar (µL) = nmol × 1.000 ÷ concentração (µM)

Para o estoque comum de 100 µM é simplesmente nmol × 10: um tubo com 25,4 nmol leva 254 µL. Se a ficha informar µg, nmol = µg × 1.000 ÷ peso molecular.

Passo a passo

Centrifugue rapidamente o tubo fechado para que o pellet seco fique no fundo, e não na tampa.
Adicione o volume calculado de TE com pouco EDTA (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8) ou de água livre de nucleases.
Agite no vórtex, deixe alguns minutos em temperatura ambiente, agite de novo e centrifugue rapidamente.

Preparando uma solução de trabalho

No PCR os primers costumam ser usados a 10 µM. A partir de um estoque de 100 µM é uma diluição 1:10: 10 µL de estoque mais 90 µL de água ou TE dão 100 µL a 10 µM. Usar um tubo de trabalho evita pipetar o estoque repetidas vezes.

Água ou TE?

O TE mantém o pH estável, e a água levemente ácida pode danificar o DNA aos poucos, então estoques em TE duram mais. O pouco EDTA do TE com baixo EDTA não prende magnésio suficiente para atrapalhar um PCR nas diluições de trabalho. Algumas aplicações, como certas reações de sequenciamento, pedem água.

Armazenamento

Guarde os estoques a −20 °C. Divida-os em algumas alíquotas para que um tubo contaminado ou descongelado demais não custe o pedido inteiro; oligos secos duram anos, e estoques em TE, muitos meses congelados.

Calculadoras

A calculadora de ressuspensão de oligos dá o volume para qualquer concentração de estoque e a mistura para uma solução de trabalho. Estatísticas de primers de PCR dá o peso molecular de um primer, e a calculadora de diluição resolve qualquer outra diluição.

Ferramentas deste guia

Calculadora de ressuspensão de oligos Análise de primers de PCR Calculadora de diluição

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