Por que usar uma razão molar
A ligação depende do número de extremidades de DNA, não da massa. Um inserto pequeno tem muito mais moléculas por ng do que um vetor grande, então massas iguais dariam números de moléculas muito diferentes. Por isso os protocolos dão uma razão molar entre inserto e vetor, quase sempre 3:1.
A fórmula
inserto (ng) = vetor (ng) × tamanho do inserto ÷ tamanho do vetor × razão
Com 50 ng de um vetor de 3.000 pb e um inserto de 1.000 pb a 3:1: 50 × 1.000 ÷ 3.000 × 3 = 50 ng de inserto.
Dicas
- Teste 1:1, 3:1 e 5:1 se a primeira tentativa der poucas colônias.
- Insertos muito curtos, como oligos anelados, costumam precisar de razões maiores.
- Inclua uma ligação só com o vetor como controle do fundo de vetor não cortado ou religado.
- Meça as concentrações depois da purificação, não antes.
Calculadora
A Calculadora de ligação dá os ng de inserto para qualquer razão e, com a concentração do inserto, o volume a pipetar. Meça essa concentração com a Calculadora de concentração de DNA.
Um exemplo com volumes
Pelo exemplo acima, você precisa de 50 ng de vetor e 50 ng de inserto. Se o vetor está a 50 ng/µL e o inserto a 25 ng/µL:
- Vetor: 50 ÷ 50 = 1 µL.
- Inserto: 50 ÷ 25 = 2 µL.
- Tampão de ligase 10×: 2 µL. DNA ligase T4: 1 µL.
- Água até 20 µL: 14 µL.
Conferindo em mols
Um par de bases de DNA de fita dupla pesa cerca de 650 g/mol, então pmol = ng × 1.000 ÷ (pb × 650). O vetor dá 50.000 ÷ (3.000 × 650) ≈ 0,026 pmol e o inserto 50.000 ÷ (1.000 × 650) ≈ 0,077 pmol, o triplo.
Poucas colônias ou nenhuma
- O ATP do tampão de ligase se degrada a cada congelamento e descongelamento. Guarde o tampão em alíquotas pequenas.
- Extremidades cegas ligam muito menos que extremidades coesivas; use mais ligase e uma incubação mais longa.
- Um vetor desfosforilado precisa de um inserto que ainda tenha os fosfatos 5′; produtos de PCR feitos com primers comuns não têm.