Por que usar uma razão molar
A ligação depende do número de extremidades de DNA, não da massa. Um inserto pequeno tem muito mais moléculas por ng do que um vetor grande, então massas iguais dariam números de moléculas muito diferentes. Por isso os protocolos dão uma razão molar entre inserto e vetor, quase sempre 3:1.
A fórmula
inserto (ng) = vetor (ng) × tamanho do inserto ÷ tamanho do vetor × razão
Com 50 ng de um vetor de 3.000 pb e um inserto de 1.000 pb a 3:1: 50 × 1.000 ÷ 3.000 × 3 = 50 ng de inserto.
Dicas
- Teste 1:1, 3:1 e 5:1 se a primeira tentativa der poucas colônias.
- Insertos muito curtos, como oligos anelados, costumam precisar de razões maiores.
- Inclua uma ligação só com o vetor como controle do fundo de vetor não cortado ou religado.
- Meça as concentrações depois da purificação, não antes.
Calculadora
A Calculadora de ligação dá os ng de inserto para qualquer razão e, com a concentração do inserto, o volume a pipetar. Meça essa concentração com a Calculadora de concentração de DNA.