Почему мольное соотношение
Лигирование зависит от числа концов ДНК, а не от их массы. В маленькой вставке гораздо больше молекул на нанограмм, чем в большом векторе, так что равные массы дали бы очень неравное число молекул. Поэтому протоколы указывают мольное соотношение вставки и вектора, чаще всего 3:1.
Формула
вставка (нг) = вектор (нг) × длина вставки ÷ длина вектора × соотношение
Для 50 нг вектора длиной 3000 п. н. и вставки 1000 п. н. при 3:1: 50 × 1000 ÷ 3000 × 3 = 50 нг вставки.
Советы
- Попробуйте 1:1, 3:1 и 5:1, если первая попытка даёт мало колоний.
- Очень коротким вставкам, например отожжённым олигонуклеотидам, часто нужны более высокие соотношения.
- Поставьте лигирование только с вектором как контроль фона от неразрезанного или самолигированного вектора.
- Измеряйте концентрации после очистки, а не до.
Калькулятор
Калькулятор лигирования даёт нанограммы вставки для любого соотношения, а с концентрацией вставки — объём для пипетирования. Эту концентрацию измерьте в Калькулятор концентрации ДНК.
Разобранный пример с объёмами
По примеру выше нужно 50 нг вектора и 50 нг вставки. Если вектор в концентрации 50 нг/мкл, а вставка — 25 нг/мкл:
- Вектор: 50 ÷ 50 = 1 мкл.
- Вставка: 50 ÷ 25 = 2 мкл.
- 10× лигазный буфер: 2 мкл. ДНК-лигаза T4: 1 мкл.
- Вода до 20 мкл: 14 мкл.
Проверка в молях
Пара оснований двуцепочечной ДНК весит около 650 г/моль, поэтому пмоль = нг × 1000 ÷ (п. н. × 650). Вектора 50 000 ÷ (3000 × 650) ≈ 0,026 пмоль, а вставки 50 000 ÷ (1000 × 650) ≈ 0,077 пмоль, втрое больше.
Мало колоний или нет совсем
- АТФ в лигазном буфере разрушается при многократном замораживании и оттаивании. Храните буфер небольшими аликвотами.
- Тупые концы лигируются гораздо хуже липких; берите больше лигазы и более долгую инкубацию.
- Дефосфорилированному вектору нужна вставка, у которой сохранились 5′-фосфаты; у продуктов ПЦР с обычными праймерами их нет.