Как считать клетки в камере Горяева

Подсчёт

1. Смешайте клетки с трипановым синим, часто 1:1; он окрашивает мёртвые клетки в синий.
2. Внесите около 10 мкл под покровное стекло.
3. Посчитайте неокрашенные клетки в четырёх больших угловых квадратах. Считайте клетки, касающиеся верхней и левой линий, но не нижней и правой, чтобы ни одна не попала в счёт дважды.
4. Если нужна жизнеспособность, отдельно посчитайте синие клетки.

Здесь описана сетка Нойбауэра; у камеры Горяева другая разметка (большие квадраты 1/25 мм²), поэтому для неё используйте множитель из её паспорта.

Формула

Каждый большой квадрат — 1 мм × 1 мм при глубине 0,1 мм, то есть 0,1 мкл, или 10⁻⁴ мл. Поэтому:

клеток на мл = средний счёт на квадрат × коэффициент разведения × 10⁴

Счёты 50, 46, 52 и 48 в среднем дают 49. При разведении трипановым синим 1:1 (коэффициент 2): 49 × 2 × 10⁴ = 9,8 × 10⁵ клеток/мл.

Жизнеспособность — живые клетки, делённые на все клетки, умноженные на 100.

Разобранные примеры

• Без разведения: счёты 120, 132, 118 и 126 в среднем дают 124. Клеток на мл = 124 × 1 × 10⁴ = 1,24 × 10⁶ клеток/мл.
• Трипановый синий 1:1, с мёртвыми клетками: живых в среднем 62, мёртвых — 8. Живых клеток на мл = 62 × 2 × 10⁴ = 1,24 × 10⁶ клеток/мл; жизнеспособность = 62 ÷ (62 + 8) = 89%.
• Слишком густо, сначала разведено 1:10: в среднем 45 после разведения 1:10, а затем 1:1 трипановым синим (общий коэффициент 20). Клеток на мл = 45 × 20 × 10⁴ = 9 × 10⁶ клеток/мл в исходной суспензии.
• Всего клеток и объём для посева: 1,24 × 10⁶ клеток/мл в 10 мл — это 1,24 × 10⁷ клеток. Чтобы посеять 5 × 10⁵ клеток, возьмите 5 × 10⁵ ÷ 1,24 × 10⁶ = 0,40 мл.

Правильный коэффициент разведения

Коэффициент разведения — это общий объём, делённый на объём клеточной суспензии в нём. Равные части клеток и трипанового синего — 2; 100 мкл клеток в 900 мкл среды — 10; и то и другое вместе — 20. Если в квадрате меньше примерно 20 или больше примерно 200 клеток, оценка получается плохой, так что густые суспензии разводите, а для редких считайте больше квадратов.

Время удвоения

По двум подсчётам: время удвоения = время × ln 2 ÷ ln(N₂ ÷ N₁). Клетки, выросшие с 1 × 10⁵ до 8 × 10⁵ за 48 часов, удвоились трижды — каждые 16 часов.

Калькуляторы

Калькулятор камеры Горяева даёт клетки на мл, жизнеспособность и объём для посева заданного числа клеток. Калькулятор времени удвоения клеток рассчитывает время удвоения и скорость роста.