हीमोसाइटोमीटर से कोशिकाएँ कैसे गिनें

गिनती

1. कोशिकाओं को ट्रिपैन ब्लू के साथ मिलाएँ, अक्सर 1:1, जो मृत कोशिकाओं को नीला रंग देता है।
2. कवरस्लिप के नीचे लगभग 10 µL भरें।
3. चारों कोनों के बड़े वर्गों में बिना रंग वाली कोशिकाएँ गिनें। ऊपर और बाईं लाइन को छूने वाली कोशिकाएँ गिनें, नीचे और दाईं लाइन वाली नहीं, ताकि कोई दो बार न गिनी जाए।
4. वायबिलिटी चाहिए तो नीली कोशिकाएँ अलग गिनें।

फ़ॉर्मूला

हर बड़ा वर्ग 1 mm × 1 mm और 0.1 mm गहरा होता है, यानी 0.1 µL, या 10⁻⁴ mL। इसलिए:

प्रति mL कोशिकाएँ = प्रति वर्ग औसत गिनती × डाइल्यूशन फ़ैक्टर × 10⁴

50, 46, 52 और 48 की गिनती का औसत 49 है। 1:1 ट्रिपैन ब्लू डाइल्यूशन (फ़ैक्टर 2) के साथ: 49 × 2 × 10⁴ = 9.8 × 10⁵ कोशिकाएँ/mL।

वायबिलिटी जीवित कोशिकाओं को कुल कोशिकाओं से भाग देकर 100 से गुणा करने पर मिलती है।

हल किए हुए उदाहरण

• बिना डाइल्यूशन: 120, 132, 118 और 126 की गिनती का औसत 124 है। सेल प्रति mL = 124 × 1 × 10⁴ = 1.24 × 10⁶ सेल/mL।
• ट्रिपैन ब्लू 1:1, मृत कोशिकाओं के साथ: जीवित का औसत 62, मृत का औसत 8। जीवित सेल प्रति mL = 62 × 2 × 10⁴ = 1.24 × 10⁶ सेल/mL; वायबिलिटी = 62 ÷ (62 + 8) = 89%।
• बहुत घना, पहले 1:10 डाइल्यूट किया: 1:10 डाइल्यूशन और फिर ट्रिपैन ब्लू के साथ 1:1 मिलाने के बाद औसत 45 (कुल फ़ैक्टर 20)। सेल प्रति mL = 45 × 20 × 10⁴ = 9 × 10⁶ सेल/mL मूल सस्पेंशन में।
• कुल सेल और सीड करने का आयतन: 10 mL में 1.24 × 10⁶ सेल/mL यानी 1.24 × 10⁷ सेल। 5 × 10⁵ सेल सीड करने के लिए 5 × 10⁵ ÷ 1.24 × 10⁶ = 0.40 mL लें।

डाइल्यूशन फ़ैक्टर सही रखना

डाइल्यूशन फ़ैक्टर कुल आयतन को उसमें मौजूद सेल सस्पेंशन के आयतन से भाग देने पर मिलता है। सेल और ट्रिपैन ब्लू बराबर मात्रा में हों तो 2; 900 µL मीडियम में 100 µL सेल हों तो 10; दोनों करें तो 20। एक वर्ग में लगभग 20 से कम या लगभग 200 से ज़्यादा सेल गिनने पर अनुमान खराब आता है, इसलिए घने सस्पेंशन को डाइल्यूट करें और कम घने के लिए ज़्यादा वर्ग गिनें।

डबलिंग टाइम

दो गिनतियों से: डबलिंग टाइम = समय × ln 2 ÷ ln(N₂ ÷ N₁)। जो कोशिकाएँ 48 घंटे में 1 × 10⁵ से 8 × 10⁵ हो जाती हैं, वे तीन बार दोगुनी हुईं, हर 16 घंटे में।

कैलकुलेटर

हीमोसाइटोमीटर कैलकुलेटर प्रति mL कोशिकाएँ, वायबिलिटी और तय संख्या की कोशिकाएँ सीड करने का आयतन बताता है। कोशिका दोहरीकरण समय कैलकुलेटर डबलिंग टाइम और ग्रोथ रेट निकालता है।