Hemositometreyle hücreler nasıl sayılır

Sayım

1. Hücreleri ölü hücreleri maviye boyayan tripan mavisiyle, çoğu zaman 1:1 karıştır.
2. Lamelin altına yaklaşık 10 µL yükle.
3. Dört büyük köşe karesindeki boyanmamış hücreleri say. Hiçbiri iki kez sayılmasın diye üst ve sol çizgilere değen hücreleri say, alt ve sağa değenleri sayma.
4. Canlılığı istiyorsan mavi hücreleri ayrıca say.

Formül

Her büyük kare 1 mm × 1 mm ve 0,1 mm derinliktedir; bu 0,1 µL, yani 10⁻⁴ mL’dir. Bu yüzden:

mL başına hücre = kare başına ortalama sayım × seyreltme katsayısı × 10⁴

50, 46, 52 ve 48’lik sayımların ortalaması 49’dur. 1:1 tripan mavisi seyreltmesiyle (katsayı 2): 49 × 2 × 10⁴ = 9,8 × 10⁵ hücre/mL.

Canlılık, canlı hücrelerin tüm hücrelere bölümü çarpı 100’dür.

Çözümlü örnekler

• Seyreltme yok: 120, 132, 118 ve 126’lık sayımların ortalaması 124. mL başına hücre = 124 × 1 × 10⁴ = 1,24 × 10⁶ hücre/mL.
• Ölü hücrelerle 1:1 tripan mavisi: canlı sayımların ortalaması 62, ölü sayımlarınki 8. mL başına canlı hücre = 62 × 2 × 10⁴ = 1,24 × 10⁶ hücre/mL; canlılık = 62 ÷ (62 + 8) = %89.
• Çok yoğun, önce 1:10 seyreltilmiş: 1:10 seyreltmeden ve sonra tripan mavisiyle 1:1’den sonra (toplam katsayı 20) sayımların ortalaması 45. Özgün süspansiyonda mL başına hücre = 45 × 20 × 10⁴ = 9 × 10⁶ hücre/mL.
• Toplam hücre ve ekilecek hacim: 10 mL’de 1,24 × 10⁶ hücre/mL, 1,24 × 10⁷ hücredir. 5 × 10⁵ hücre ekmek için 5 × 10⁵ ÷ 1,24 × 10⁶ = 0,40 mL al.

Seyreltme katsayısını doğru almak

Seyreltme katsayısı toplam hacmin içindeki hücre süspansiyonu hacmine bölümüdür. Eşit miktarda hücre ve tripan mavisi 2’dir; 900 µL besiyerinde 100 µL hücre 10’dur; ikisini birden yapmak 20’dir. Kare başına yaklaşık 20’den az ya da 200’den fazla hücre saymak kötü tahminler verir; bu yüzden yoğun süspansiyonları seyrelt, seyrek olanlar için daha çok kare say.

İkilenme süresi

İki sayımdan: ikilenme süresi = süre × ln 2 ÷ ln(N₂ ÷ N₁). 48 saatte 1 × 10⁵’ten 8 × 10⁵’e büyüyen hücreler üç kez, her 16 saatte bir ikiye katlanmıştır.

Hesaplayıcılar

Hemositometre hesaplayıcı mL başına hücreyi, canlılığı ve hedef hücre sayısı için ekilecek hacmi verir. Hücre ikilenme süresi hesaplayıcı ikilenme süresini ve büyüme hızını hesaplar.