Transformasyon verimi nasıl hesaplanır

Formül

Transformasyon verimi, her şeyi ekmiş olsan mikrogram plazmit DNA başına alacağın koloni sayısıdır:

verim (cfu/µg) = koloni × (toplam hacim ÷ ekilen hacim) × seyreltme faktörü ÷ DNA’nın µg’ı

Sonuç hücreler kadar plazmite de bağlı olduğu için pUC19 gibi kesilmemiş, süpersarmal bir kontrol plazmitinin bilinen bir miktarıyla ölçülür.

Çözümlü bir örnek

50 µL kompetan hücreye 10 pg (0,00001 µg) pUC19 ekliyorsun, ısı şokundan sonra 950 µL SOC ekliyorsun (toplam 1.000 µL) ve 1:10 seyreltmenin 100 µL’sini ekiyorsun. Ertesi gün 45 koloni var.

1. Ekilen oran: 100 ÷ 1.000 = 0,1; yani 10 ile çarp.
2. Seyreltme: 1:10; yani yine 10 ile çarp.
3. Transformasyon başına koloni: 45 × 10 × 10 = 4.500.
4. µg başına: 4.500 ÷ 0,00001 = 4,5 × 10⁸ cfu/µg.

İyi bir sayı nedir?

• Kendi hazırladığın kimyasal kompetan hücreler: 10⁶ ila 10⁷ cfu/µg.
• Ticari kimyasal kompetan hücreler: 10⁸ ila 10⁹.
• Elektrokompetan hücreler: 10⁹ ila 10¹⁰.

Bir ligasyon, µg başına kontrol plazmitinden çok daha az koloni verir; çoğu zaman yüz ila bin kat az, çünkü ligasyona uğramış DNA çoğunlukla doğrusal ya da gevşektir ve ligasyon tamponu transformasyonu baskılar.

Verim neden düşer

Çok fazla DNA (50 µL hücre başına yaklaşık 100 ng’dan fazlası) hücreleri doyurur ve µg başına sayıyı düşürür. DNA’daki tuz, etanol ya da ligaz tamponu, ısı şokundan önce ısınmış hücreler, çözdürülüp yeniden dondurulmuş hücreler ve toparlanma adımının atlanması verimi düşürür. Büyük plazmitler küçüklerden daha kötü transforme olur.

Hesaplayıcılar

Transformasyon verimi hesaplayıcı hesabı kolonilerden, DNA’dan, hacimlerden ve seyreltmeden yapar. DNA miktarını DNA derişimi hesaplayıcı ile kontrol et, nanogramları DNA kopya sayısı hesaplayıcı ile moleküle çevir.