DNA kopya sayısı nasıl hesaplanır

Formül

kopya = (ng cinsinden kütle × 6,022 × 10²³) ÷ (bp cinsinden uzunluk × 660 × 10⁹)

660 g/mol, çift iplikli DNA’nın bir baz çiftinin ortalama kütlesidir (tek iplikli DNA için baz başına yaklaşık 330, RNA için 340), 6,022 × 10²³ Avogadro sayısıdır ve 10⁹ nanogramı grama çevirir. Molekül uzadıkça bir nanogramın tuttuğu kopya azalır.

Çözümlü bir örnek

5.000 bp’lik bir plazmitin 1 ng’ında kaç molekül var?

1. Molar kütle: 5.000 × 660 = 3,3 × 10⁶ g/mol.
2. Mol: 1 × 10⁻⁹ g ÷ 3,3 × 10⁶ g/mol = 3,03 × 10⁻¹⁶ mol.
3. Kopya: 3,03 × 10⁻¹⁶ × 6,022 × 10²³ = 1,8 × 10⁸ kopya.

Pratik bir kural: 1 kb’lik bir parçanın 1 ng’ı yaklaşık 9 × 10⁸ kopyadır ve 1 bp’nin 1 ng’ı 9 × 10¹¹ olurdu; yani bp cinsinden uzunluğa böl.

Kopyadan kütleye geri

Yeniden düzenlenirse: kütle (ng) = kopya × uzunluk × 660 × 10⁹ ÷ 6,022 × 10²³. Aynı plazmitin 10⁶ kopyası için bu 10⁶ × 5.000 × 660 × 10⁹ ÷ 6,022 × 10²³ = 5,5 × 10⁻³ ng, yani 5,5 pg’dır.

qPCR standart eğrisi

Mutlak niceleme, kopya sayısı bilinen standartlar ister. Plazmit derişimini ölç, onu µL başına kopyaya çevir, sonra örneğin µL başına 10⁸’den 10² kopyaya kadar on kat seri seyreltmeler yap. Onları örneklerle birlikte çalıştır; Ct’nin log kopyaya karşı grafiği, eğimi −3,3’e yakın (%100 verim) bir doğru olmalıdır. Doğrusallaştırılmış plazmit süpersarmal olandan daha doğru standartlar verir ve tRNA ya da maya RNA’sı gibi bir taşıyıcı, az kopyalı seyreltmelerin tüp duvarlarına yapışmasını önler.

Hesaplayıcılar

DNA kopya sayısı hesaplayıcı her uzunlukta DNA ya da RNA için nanogram ile kopya arasında çevirir. Derişimi bir A260 okumasından DNA derişimi hesaplayıcı ile al; mutlak değil göreli niceleme için ΔΔCt hesaplayıcıyı kullan.