La formule
copies = (masse en ng × 6,022 × 1023) ÷ (longueur en pb × 660 × 109)
660 g/mol est la masse moyenne d'une paire de bases d'ADN double brin (environ 330 par base pour l'ADN simple brin et 340 pour l'ARN), 6,022 × 1023 est le nombre d'Avogadro et 109 convertit les nanogrammes en grammes. Plus la molécule est longue, moins un nanogramme contient de copies.
Un exemple chiffré
Combien de molécules dans 1 ng d'un plasmide de 5 000 pb ?
- Masse molaire : 5 000 × 660 = 3,3 × 106 g/mol.
- Moles : 1 × 10−9 g ÷ 3,3 × 106 g/mol = 3,03 × 10−16 mol.
- Copies : 3,03 × 10−16 × 6,022 × 1023 = 1,8 × 108 copies.
Règle pratique : 1 ng d'un fragment de 1 kb représente environ 9 × 108 copies, et 1 ng de 1 pb en ferait 9 × 1011 ; divisez donc par la longueur en pb.
Des copies à la masse
En réarrangeant : masse (ng) = copies × longueur × 660 × 109 ÷ 6,022 × 1023. Pour 106 copies du même plasmide, cela fait 106 × 5 000 × 660 × 109 ÷ 6,022 × 1023 = 5,5 × 10−3 ng, soit 5,5 pg.
Une gamme étalon de qPCR
La quantification absolue demande des étalons au nombre de copies connu. Mesurez la concentration du plasmide, convertissez-la en copies par µL, puis faites des dilutions en série au 1/10, par exemple de 108 à 102 copies par µL. Passez-les avec les échantillons ; le tracé du Ct en fonction du log des copies doit être une droite de pente proche de −3,3 (efficacité de 100 %). Un plasmide linéarisé donne des étalons plus justes que le surenroulé, et un transporteur comme de l'ARNt ou de l'ARN de levure empêche les dilutions à faible nombre de copies d'adhérer aux parois des tubes.
Outils
Calcul du nombre de copies d’ADN convertit nanogrammes et copies pour de l'ADN ou de l'ARN de toute longueur. Obtenez la concentration à partir d'une lecture à 260 nm avec Calcul de concentration d’ADN ; pour une quantification relative plutôt qu'absolue, utilisez Calcul ΔΔCt.