Comment fonctionne le gel
Le SDS recouvre les protéines d’une charge négative proportionnelle à leur longueur : dans un champ électrique, elles migrent dans le maillage de polyacrylamide selon leur seule taille. Le gel a deux couches : un court gel de concentration, à pH et pourcentage faibles, qui ramasse chaque échantillon en une bande fine, et dessous un gel de séparation qui sépare les protéines.
Choisir le pourcentage
- 8 % : environ 40 à 200 kDa
- 10 % : environ 20 à 150 kDa
- 12 % : environ 15 à 100 kDa, un choix général courant
- 15 % : environ 10 à 70 kDa
Le gel de concentration est en général à 4 % ou 5 %.
Rôle de chaque ingrédient
- Acrylamide/bis : forme le maillage ; son pourcentage fixe la taille des pores.
- Tris-HCl : pH 8,8 à 0,375 M dans le gel de séparation, pH 6,8 à 0,125 M dans le gel de concentration. Cet écart de pH concentre les échantillons.
- SDS : 0,1 %, garde les protéines dénaturées et chargées.
- APS et TEMED : lancent la polymérisation. Ajoutez-les en dernier, car le gel commence à prendre en quelques minutes.
Couler les gels
- Montez les plaques de verre et vérifiez l’étanchéité avec de l’eau.
- Mélangez le gel de séparation, ajoutez APS et TEMED, agitez et coulez jusqu’à environ 1,5 cm sous l’endroit où arriveront les dents du peigne.
- Recouvrez d’isopropanol ou d’eau pour une surface plane, et laissez prendre 20 à 30 minutes.
- Videz la couche de recouvrement, mélangez le gel de concentration avec son APS et son TEMED, coulez-le par-dessus et insérez le peigne.
- Laissez prendre, retirez le peigne et rincez les puits.
L’acrylamide non polymérisée est neurotoxique : portez des gants et manipulez les solutions avec précaution.
Calculateurs
Le calcul de gel SDS-PAGE donne tous les volumes des gels de séparation et de concentration pour tout pourcentage et nombre de gels. Pour déposer la même quantité de protéines, mesurez vos échantillons avec le calcul de la concentration en protéines.