Cara Membuat Gel SDS-PAGE

Cara kerja gel

SDS melapisi protein dengan muatan negatif sebanding dengan panjangnya, sehingga dalam medan listrik protein bergerak melalui jaringan poliakrilamida hanya menurut ukurannya. Gel punya dua lapisan: gel penumpuk pendek dengan pH dan persentase rendah yang memadatkan tiap sampel menjadi pita tipis, dan gel pemisah di bawahnya yang memisahkan protein.

Memilih persentase

• 8%: sekitar 40 sampai 200 kDa
• 10%: sekitar 20 sampai 150 kDa
• 12%: sekitar 15 sampai 100 kDa, pilihan umum
• 15%: sekitar 10 sampai 70 kDa

Gel penumpuk biasanya 4% atau 5%.

Fungsi tiap bahan

• Akrilamida/bis: membentuk jaringan gel; persentasenya menentukan ukuran pori.
• Tris-HCl: pH 8,8 pada 0,375 M di gel pemisah, pH 6,8 pada 0,125 M di gel penumpuk. Perbedaan pH inilah yang menumpuk sampel.
• SDS: 0,1%, menjaga protein tetap terdenaturasi dan bermuatan.
• APS dan TEMED: memulai polimerisasi. Tambahkan terakhir, karena gel mulai mengeras dalam beberapa menit.

Menuang gel

1. Rakit pelat kaca dan periksa kebocoran dengan air.
2. Campur gel pemisah, tambahkan APS dan TEMED, putar, lalu tuang hingga sekitar 1,5 cm di bawah ujung gigi sisir nantinya.
3. Lapisi dengan isopropanol atau air agar tepinya rata, lalu biarkan mengeras 20 sampai 30 menit.
4. Buang lapisan atas, campur gel penumpuk dengan APS dan TEMED-nya, tuang di atasnya, lalu pasang sisir.
5. Biarkan mengeras, cabut sisir, lalu bilas sumurnya.

Akrilamida yang belum berpolimerisasi adalah neurotoksin: pakai sarung tangan dan tangani larutannya dengan hati-hati.

Kalkulator

Kalkulator gel SDS-PAGE mencantumkan setiap volume gel pemisah dan gel penumpuk untuk persentase dan jumlah gel berapa pun. Untuk memuat jumlah protein yang sama, ukur sampel Anda dengan kalkulator konsentrasi protein.