Cara Merancang dan Memeriksa Primer PCR

Ciri primer yang baik

• Panjang: 18 sampai 30 basa.
• Kadar GC: 40 sampai 60%.
• Suhu leleh: sekitar 55 sampai 65 °C, dengan selisih kedua primer dalam satu pasang tidak lebih dari sekitar 5 °C.
• Ujung 3′: diakhiri G atau C, yang disebut GC clamp, tetapi tidak lebih dari 3 G atau C dalam 5 basa terakhir.
• Hindari: pengulangan basa yang sama, bagian yang berpasangan dengan primer itu sendiri (hairpin dan dimer primer), dan bagian yang berpasangan dengan primer lainnya.

Suhu leleh

Rumus paling sederhana menghitung 2 °C untuk setiap A atau T dan 4 °C untuk setiap G atau C, dan hanya layak untuk primer pendek. Primer yang lebih panjang lebih baik diperkirakan dengan rumus berbasis GC, dengan koreksi garam, atau paling baik dengan metode nearest-neighbor, yang melihat setiap pasangan basa bertetangga dan memperhitungkan konsentrasi primer dan natrium.

Memeriksa primer Anda

1. Tempel primer Anda, satu per baris, ke Statistik Primer PCR.
2. Isi konsentrasi primer dan natrium reaksi Anda.
3. Bandingkan nilai Tm dan baca peringatan tentang hairpin, dimer diri, pengulangan, atau ujung 3′.

Memeriksa produknya

Produk PCR menemukan tempat primer forward dan reverse menempel pada templat dan memberikan ukuran serta sekuens setiap produk, sehingga situs tempel tambahan terlihat sebelum Anda menjalankan gel. Peta Primer menggambar sekumpulan primer pada sekuens dengan panah yang menunjukkan arahnya.