Ciri primer yang baik
- Panjang: 18 sampai 30 basa.
- Kadar GC: 40 sampai 60%.
- Suhu leleh: sekitar 55 sampai 65 °C, dengan selisih kedua primer dalam satu pasang tidak lebih dari sekitar 5 °C.
- Ujung 3′: diakhiri G atau C, yang disebut GC clamp, tetapi tidak lebih dari 3 G atau C dalam 5 basa terakhir.
- Hindari: pengulangan basa yang sama, bagian yang berpasangan dengan primer itu sendiri (hairpin dan dimer primer), dan bagian yang berpasangan dengan primer lainnya.
Suhu leleh
Rumus paling sederhana menghitung 2 °C untuk setiap A atau T dan 4 °C untuk setiap G atau C, dan hanya layak untuk primer pendek. Primer yang lebih panjang lebih baik diperkirakan dengan rumus berbasis GC, dengan koreksi garam, atau paling baik dengan metode nearest-neighbor, yang melihat setiap pasangan basa bertetangga dan memperhitungkan konsentrasi primer dan natrium.
Memeriksa primer Anda
- Tempel primer Anda, satu per baris, ke Statistik Primer PCR.
- Isi konsentrasi primer dan natrium reaksi Anda.
- Bandingkan nilai Tm dan baca peringatan tentang hairpin, dimer diri, pengulangan, atau ujung 3′.
Memeriksa produknya
Produk PCR menemukan tempat primer forward dan reverse menempel pada templat dan memberikan ukuran serta sekuens setiap produk, sehingga situs tempel tambahan terlihat sebelum Anda menjalankan gel. Peta Primer menggambar sekumpulan primer pada sekuens dengan panah yang menunjukkan arahnya.
Memeriksa satu primer
Ambil 5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′. Panjangnya 23 basa, 10 di antaranya G atau C, jadi kandungan GC adalah 10 ÷ 23 = 43%, di dalam rentang 40 sampai 60%. Ujungnya GG, sebuah GC clamp, dengan tiga G atau C di lima basa terakhir, batas maksimum yang lazim. Aturan sederhana 2 + 4 memberi 2 × 13 + 4 × 10 = 66 °C, yang terlalu tinggi untuk primer sepanjang ini. Perhitungan nearest-neighbor dengan kondisi garam Anda lebih andal.
Suhu annealing
Titik awal yang umum adalah sekitar 3 sampai 5 °C di bawah Tm terendah dari pasangan primer. Jika ragu, jalankan PCR gradien pada beberapa suhu dan pilih yang memberi satu pita bersih.
Menambahkan situs restriksi
Untuk mengkloning produk, tambahkan situs enzim di ujung 5′ primer, dengan 4 sampai 6 basa tambahan di depannya agar enzim bisa memotong dekat ujung. Hitung Tm hanya dari bagian yang menempel pada templat, karena ekornya tidak menempel di siklus-siklus awal.
Masalah umum
- Tidak ada produk. Turunkan suhu annealing, cocokkan urutan primer dengan templat, dan pastikan templatnya ada.
- Beberapa pita. Naikkan suhu annealing dan cari tempat lain yang mungkin ditempeli primer.
- Pita samar di bawah 100 bp. Biasanya ini dimer primer, primer yang saling menempel. Rancang ulang agar ujung 3′ tidak saling komplementer, atau turunkan konsentrasi primer.