Ce qui fait une bonne amorce
- Longueur : 18 à 30 bases.
- Teneur en GC : 40 à 60 %.
- Température de fusion : environ 55 à 65 °C, les deux amorces d’une paire à moins de 5 °C l’une de l’autre environ.
- Extrémité 3′ : finir par un G ou un C, le « GC clamp », mais sans plus de 3 G ou C dans les 5 dernières bases.
- À éviter : les répétitions d’une même base, les portions qui s’apparient avec l’amorce elle-même (épingles à cheveux et dimères d’amorces) et celles qui s’apparient avec l’autre amorce.
La température de fusion
La formule la plus simple compte 2 °C par A ou T et 4 °C par G ou C ; elle n’est raisonnable que pour les amorces courtes. Pour les plus longues, on obtient une meilleure estimation avec des formules fondées sur le GC, avec une correction pour le sel, ou mieux encore avec la méthode des plus proches voisins, qui examine chaque paire de bases voisines et tient compte des concentrations d’amorce et de sodium.
Vérifier vos amorces
- Collez vos amorces, une par ligne, dans l’Analyse d’amorces PCR.
- Indiquez les concentrations d’amorce et de sodium de votre réaction.
- Comparez les Tm et lisez les avertissements sur les épingles, les autodimères, les répétitions ou l’extrémité 3′.
Vérifier le produit
Produits de PCR trouve où les amorces sens et antisens se fixent sur une matrice et donne la taille et la séquence de chaque produit : un site de fixation en trop apparaît avant même de faire migrer un gel. La Carte des amorces dessine un ensemble d’amorces sur la séquence, avec des flèches pour leur sens.