Ce qui fait une bonne amorce
- Longueur : 18 à 30 bases.
- Teneur en GC : 40 à 60 %.
- Température de fusion : environ 55 à 65 °C, les deux amorces d’une paire à moins de 5 °C l’une de l’autre environ.
- Extrémité 3′ : finir par un G ou un C, le « GC clamp », mais sans plus de 3 G ou C dans les 5 dernières bases.
- À éviter : les répétitions d’une même base, les portions qui s’apparient avec l’amorce elle-même (épingles à cheveux et dimères d’amorces) et celles qui s’apparient avec l’autre amorce.
La température de fusion
La formule la plus simple compte 2 °C par A ou T et 4 °C par G ou C ; elle n’est raisonnable que pour les amorces courtes. Pour les plus longues, on obtient une meilleure estimation avec des formules fondées sur le GC, avec une correction pour le sel, ou mieux encore avec la méthode des plus proches voisins, qui examine chaque paire de bases voisines et tient compte des concentrations d’amorce et de sodium.
Vérifier vos amorces
- Collez vos amorces, une par ligne, dans l’Analyse d’amorces PCR.
- Indiquez les concentrations d’amorce et de sodium de votre réaction.
- Comparez les Tm et lisez les avertissements sur les épingles, les autodimères, les répétitions ou l’extrémité 3′.
Vérifier le produit
Produits de PCR trouve où les amorces sens et antisens se fixent sur une matrice et donne la taille et la séquence de chaque produit : un site de fixation en trop apparaît avant même de faire migrer un gel. La Carte des amorces dessine un ensemble d’amorces sur la séquence, avec des flèches pour leur sens.
Vérifier une amorce
Prenez 5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′. Elle compte 23 bases, dont 10 G ou C, donc le taux de GC est 10 ÷ 23 = 43 %, dans la plage de 40 à 60 %. Elle se termine par GG, une pince GC, avec trois G ou C dans les cinq dernières bases, le maximum habituel. La règle simple 2 + 4 donne 2 × 13 + 4 × 10 = 66 °C, ce qui surestime pour une amorce de cette longueur. Un calcul par plus proches voisins avec vos conditions de sel est plus fiable.
Température d’hybridation
Un point de départ courant est d’environ 3 à 5 °C sous la plus basse des deux Tm. En cas de doute, lancez une PCR en gradient sur plusieurs températures et gardez celle qui donne une seule bande nette.
Ajouter un site de restriction
Pour cloner le produit, ajoutez le site de l’enzyme à l’extrémité 5′ de l’amorce, précédé de 4 à 6 bases supplémentaires pour que l’enzyme puisse couper près de l’extrémité. Calculez la Tm sur la seule partie qui s’hybride à la matrice, car la queue ne s’hybride pas aux premiers cycles.
Problèmes fréquents
- Aucun produit. Baissez la température d’hybridation, comparez les séquences des amorces à la matrice et vérifiez que la matrice est bien présente.
- Plusieurs bandes. Montez la température d’hybridation et cherchez d’autres endroits où les amorces pourraient se fixer.
- Une bande faible sous 100 pb. C’est en général un dimère d’amorces, les amorces fixées l’une sur l’autre. Redessinez-les pour éviter des extrémités 3′ complémentaires, ou baissez leur concentration.