Como desenhar e conferir primers de PCR

O que faz um bom primer

• Comprimento: de 18 a 30 bases.
• Conteúdo de GC: de 40 a 60%.
• Temperatura de melting: mais ou menos de 55 a 65 °C, com os dois primers do par a até cerca de 5 °C um do outro.
• Extremidade 3′: terminar em G ou C, o grampo de GC, mas sem mais de 3 G ou C nas últimas 5 bases.
• Evitar: repetições da mesma base, trechos que pareiam com o próprio primer (grampos e dímeros de primer) e trechos que pareiam com o outro primer.

Temperatura de melting

A fórmula mais simples conta 2 °C para cada A ou T e 4 °C para cada G ou C, e só é razoável para primers curtos. Primers mais longos são estimados melhor com fórmulas baseadas no GC, com correção de sal, ou melhor ainda pelo método dos vizinhos mais próximos, que olha cada par de bases vizinhas e leva em conta as concentrações de primer e de sódio.

Conferir seus primers

1. Cole seus primers, um por linha, em Análise de primers de PCR.
2. Informe as concentrações de primer e de sódio da sua reação.
3. Compare os valores de Tm e leia os avisos sobre grampos, autodímeros, repetições ou a extremidade 3′.

Conferir o produto

Produtos de PCR encontra onde os primers forward e reverse se ligam a um molde e dá o tamanho e a sequência de cada produto, então um sítio de ligação extra aparece antes de você correr um gel. Mapa de primers desenha um conjunto de primers na sequência com setas indicando o sentido.