O que faz um bom primer
- Comprimento: de 18 a 30 bases.
- Conteúdo de GC: de 40 a 60%.
- Temperatura de melting: mais ou menos de 55 a 65 °C, com os dois primers do par a até cerca de 5 °C um do outro.
- Extremidade 3′: terminar em G ou C, o grampo de GC, mas sem mais de 3 G ou C nas últimas 5 bases.
- Evitar: repetições da mesma base, trechos que pareiam com o próprio primer (grampos e dímeros de primer) e trechos que pareiam com o outro primer.
Temperatura de melting
A fórmula mais simples conta 2 °C para cada A ou T e 4 °C para cada G ou C, e só é razoável para primers curtos. Primers mais longos são estimados melhor com fórmulas baseadas no GC, com correção de sal, ou melhor ainda pelo método dos vizinhos mais próximos, que olha cada par de bases vizinhas e leva em conta as concentrações de primer e de sódio.
Conferir seus primers
- Cole seus primers, um por linha, em Análise de primers de PCR.
- Informe as concentrações de primer e de sódio da sua reação.
- Compare os valores de Tm e leia os avisos sobre grampos, autodímeros, repetições ou a extremidade 3′.
Conferir o produto
Produtos de PCR encontra onde os primers forward e reverse se ligam a um molde e dá o tamanho e a sequência de cada produto, então um sítio de ligação extra aparece antes de você correr um gel. Mapa de primers desenha um conjunto de primers na sequência com setas indicando o sentido.
Verificando um primer
Pegue 5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′. Ele tem 23 bases, 10 delas G ou C, então o conteúdo GC é 10 ÷ 23 = 43%, dentro da faixa de 40 a 60%. Termina em GG, um grampo GC, com três G ou C nas últimas cinco bases, o máximo usual. A regra simples 2 + 4 dá 2 × 13 + 4 × 10 = 66 °C, o que superestima para um primer desse tamanho. Um cálculo de vizinhos mais próximos com suas condições de sal é mais confiável.
Temperatura de anelamento
Um ponto de partida comum é cerca de 3 a 5 °C abaixo da menor Tm do par. Na dúvida, faça uma PCR em gradiente com várias temperaturas e escolha a que der uma única banda limpa.
Adicionando um sítio de restrição
Para clonar o produto, adicione o sítio da enzima à ponta 5′ do primer, com 4 a 6 bases extras antes dele para que a enzima consiga cortar perto da ponta. Calcule a Tm só com a parte que se liga ao molde, porque a cauda não se liga nos primeiros ciclos.
Problemas comuns
- Nenhum produto. Baixe a temperatura de anelamento, confira as sequências dos primers contra o molde e confirme que o molde está presente.
- Várias bandas. Aumente a temperatura de anelamento e procure outros lugares onde os primers possam se ligar.
- Uma banda fraca abaixo de 100 pb. Geralmente é dímero de primers, os primers ligados um ao outro. Redesenhe para evitar pontas 3′ complementares ou reduza a concentração dos primers.