PCR-Primer entwerfen und prüfen

Was einen guten Primer ausmacht

• Länge: 18 bis 30 Basen.
• GC-Gehalt: 40 bis 60%.
• Schmelztemperatur: etwa 55 bis 65 °C, die beiden Primer eines Paares höchstens rund 5 °C auseinander.
• 3′-Ende: auf G oder C enden, die GC-Klammer, aber nicht mehr als 3 G oder C unter den letzten 5 Basen.
• Vermeiden: Wiederholungen derselben Base, Abschnitte, die mit dem Primer selbst paaren (Haarnadeln und Primer-Dimere), und Abschnitte, die mit dem anderen Primer paaren.

Schmelztemperatur

Die einfachste Formel zählt 2 °C für jedes A oder T und 4 °C für jedes G oder C und taugt nur für kurze Primer. Längere Primer schätzt man besser mit GC-basierten Formeln, mit Salzkorrektur oder am besten mit der Nearest-Neighbor-Methode, die jedes Paar benachbarter Basen betrachtet und Primer- und Natriumkonzentration berücksichtigt.

Die eigenen Primer prüfen

1. Die Primer, einen pro Zeile, in die PCR-Primer-Analyse einfügen.
2. Primer- und Natriumkonzentration der eigenen Reaktion eintragen.
3. Die Tm-Werte vergleichen und die Warnungen zu Haarnadeln, Selbst-Dimeren, Wiederholungen oder dem 3′-Ende lesen.

Das Produkt prüfen

PCR-Produkte findet, wo Forward- und Reverse-Primer an eine Vorlage binden, und gibt Größe und Sequenz jedes Produkts an. Eine zusätzliche Bindestelle fällt so vor dem Gel auf. Die Primer-Karte zeichnet mehrere Primer mit Pfeilen für ihre Richtung auf die Sequenz.