PCR-Primer entwerfen und prüfen

Was einen guten Primer ausmacht

• Länge: 18 bis 30 Basen.
• GC-Gehalt: 40 bis 60%.
• Schmelztemperatur: etwa 55 bis 65 °C, die beiden Primer eines Paares höchstens rund 5 °C auseinander.
• 3′-Ende: auf G oder C enden, die GC-Klammer, aber nicht mehr als 3 G oder C unter den letzten 5 Basen.
• Vermeiden: Wiederholungen derselben Base, Abschnitte, die mit dem Primer selbst paaren (Haarnadeln und Primer-Dimere), und Abschnitte, die mit dem anderen Primer paaren.

Schmelztemperatur

Die einfachste Formel zählt 2 °C für jedes A oder T und 4 °C für jedes G oder C und taugt nur für kurze Primer. Längere Primer schätzt man besser mit GC-basierten Formeln, mit Salzkorrektur oder am besten mit der Nearest-Neighbor-Methode, die jedes Paar benachbarter Basen betrachtet und Primer- und Natriumkonzentration berücksichtigt.

Die eigenen Primer prüfen

1. Die Primer, einen pro Zeile, in die PCR-Primer-Analyse einfügen.
2. Primer- und Natriumkonzentration der eigenen Reaktion eintragen.
3. Die Tm-Werte vergleichen und die Warnungen zu Haarnadeln, Selbst-Dimeren, Wiederholungen oder dem 3′-Ende lesen.

Das Produkt prüfen

PCR-Produkte findet, wo Forward- und Reverse-Primer an eine Vorlage binden, und gibt Größe und Sequenz jedes Produkts an. Eine zusätzliche Bindestelle fällt so vor dem Gel auf. Die Primer-Karte zeichnet mehrere Primer mit Pfeilen für ihre Richtung auf die Sequenz.

Einen Primer prüfen

Nimm 5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′. Er ist 23 Basen lang, 10 davon G oder C, der GC-Gehalt ist also 10 ÷ 23 = 43 %, im Bereich von 40 bis 60 %. Er endet auf GG, eine GC-Klammer, mit drei G oder C in den letzten fünf Basen, dem üblichen Maximum. Die einfache 2-plus-4-Regel ergibt 2 × 13 + 4 × 10 = 66 °C, was für einen so langen Primer zu hoch liegt. Eine Nearest-Neighbor-Berechnung mit deinen Salzbedingungen ist verlässlicher.

Annealing-Temperatur

Ein üblicher Startwert liegt etwa 3 bis 5 °C unter der niedrigeren Tm des Paars. Im Zweifel fahr eine Gradienten-PCR über mehrere Temperaturen und nimm die, die eine einzige saubere Bande ergibt.

Eine Restriktionsschnittstelle anhängen

Zum Klonieren hängst du die Erkennungssequenz des Enzyms an das 5′-Ende des Primers, mit 4 bis 6 zusätzlichen Basen davor, damit das Enzym nahe am Ende schneiden kann. Berechne die Tm nur aus dem Teil, der an die Vorlage bindet, denn der Überhang bindet in den ersten Zyklen nicht.

Häufige Probleme

• Kein Produkt. Senke die Annealing-Temperatur, vergleiche die Primersequenzen mit der Vorlage und stell sicher, dass Vorlage vorhanden ist.
• Mehrere Banden. Erhöhe die Annealing-Temperatur und such nach weiteren Stellen, an die die Primer binden könnten.
• Eine schwache Bande unter 100 bp. Meist sind das Primer-Dimere, aneinander gebundene Primer. Entwirf die Primer ohne komplementäre 3′-Enden neu, oder senke die Primerkonzentration.