Was ein Guide braucht
Für die übliche SpCas9 besteht der Guide aus 20 Basen, die zur Ziel-DNA passen, und auf das Ziel muss direkt ein NGG-PAM auf demselben Strang folgen. Cas9 schneidet 3 Basen vor dem PAM. Das PAM selbst gehört nicht zum Guide.
Zielstellen können auf beiden Strängen liegen: ein NGG auf dem unteren Strang erscheint oben als CCN.
Unter den Stellen wählen
- Lage. Für einen Knockout ein frühes Exon wählen, das alle Transkripte gemeinsam haben, damit Rasterverschiebungen das Protein zerstören. Für eine präzise Änderung sollte der Schnitt höchstens etwa 10 Basen davon entfernt liegen.
- GC-Gehalt von 40 bis 80 %. Sehr wenig GC bindet schwach, sehr viel GC kann zu leicht auch anderswo binden.
- Kein TTTT. Vier T hintereinander beenden die Transkription vom U6-Promotor, den die meisten Guide-Plasmide nutzen.
- Ein G am Anfang hilft der U6-Transkription; fehlt es, hängen viele Protokolle eines an.
Off-Targets
Ein Guide kann auch Stellen schneiden, die sich in wenigen Basen unterscheiden, besonders wenn die Fehlpaarungen weit vom PAM entfernt liegen. Prüfe die Guides deiner engeren Wahl vor der Bestellung mit einem genomweiten Suchwerkzeug und nimm die ohne ähnliche Treffer anderswo.
Kandidaten finden
Füge deine Zielsequenz in den CRISPR-Guide-Finder ein. Er listet jede Stelle auf beiden Strängen mit Position, Strang und GC-Gehalt, für NGG und andere PAMs. Mit der Restriktionskarte planst du einen Screening-Verdau um den Schnitt.