Ce qu'il faut à un guide
Pour la SpCas9 courante, le guide fait 20 bases identiques à l'ADN cible, et la cible doit être suivie directement d'un PAM NGG sur le même brin. Cas9 coupe 3 bases avant le PAM. Le PAM ne fait pas partie du guide.
Les sites peuvent être sur l'un ou l'autre brin : un NGG sur le brin inférieur apparaît comme CCN sur le brin supérieur.
Choisir parmi les sites
- Position. Pour inactiver un gène, visez un exon précoce commun à tous les transcrits, pour qu'un décalage du cadre détruise la protéine. Pour une modification précise, la coupure doit se trouver à une dizaine de bases au plus du changement.
- Teneur en GC de 40 à 80 %. Trop peu de GC se fixe mal ; trop de GC peut se fixer facilement ailleurs.
- Pas de TTTT. Quatre T à la suite arrêtent la transcription depuis le promoteur U6 qu'utilisent la plupart des plasmides de guides.
- Un G au début aide la transcription U6 ; s'il n'y en a pas, beaucoup de protocoles en ajoutent un.
Sites hors cible
Un guide peut aussi couper des sites qui ne diffèrent que de quelques bases, surtout quand les mésappariements sont loin du PAM. Avant de commander, comparez les guides retenus à tout le génome avec un outil de recherche génomique et gardez ceux sans correspondance proche ailleurs.
Trouver des sites candidats
Collez votre séquence cible dans le Chercheur de guides CRISPR. Il liste tous les sites des deux brins avec leur position, leur brin et leur teneur en GC, pour NGG et d'autres PAM. Servez-vous de la Carte de restriction pour prévoir une digestion de criblage autour de la coupure.