गाइड को क्या चाहिए
आम SpCas9 के लिए गाइड 20 बेस का होता है जो टारगेट DNA से मेल खाता है, और टारगेट के ठीक बाद उसी स्ट्रैंड पर NGG PAM होना चाहिए। Cas9 PAM से 3 बेस पहले काटता है। PAM ख़ुद गाइड का हिस्सा नहीं है।
स्थल किसी भी स्ट्रैंड पर हो सकते हैं: निचले स्ट्रैंड का NGG ऊपरी स्ट्रैंड पर CCN दिखता है।
स्थलों में से चुनना
- स्थिति। जीन नॉकआउट के लिए सभी ट्रांसक्रिप्ट में साझा किसी शुरुआती एक्सॉन को चुनें, ताकि फ़्रेमशिफ़्ट प्रोटीन बिगाड़ दे। सटीक बदलाव के लिए कट बदलाव से लगभग 10 बेस के भीतर होना चाहिए।
- GC मात्रा 40 से 80%। बहुत कम GC कमज़ोर जुड़ता है; बहुत ज़्यादा GC दूसरी जगहों पर भी आसानी से जुड़ सकता है।
- TTTT नहीं। लगातार चार T, U6 प्रोमोटर से ट्रांसक्रिप्शन रोक देते हैं, जिसे ज़्यादातर गाइड प्लाज़्मिड इस्तेमाल करते हैं।
- शुरुआत में G U6 ट्रांसक्रिप्शन में मदद करता है; न हो तो कई प्रोटोकॉल एक जोड़ देते हैं।
ऑफ़-टारगेट
गाइड उन स्थलों को भी काट सकता है जो कुछ बेस से अलग हों, ख़ासकर जब बेमेल PAM से दूर हों। ऑर्डर करने से पहले चुने गए गाइड पूरे जीनोम में किसी जीनोम-खोज टूल से जाँचें, और वही रखें जिनका कहीं और कोई क़रीबी मेल न हो।
संभावित स्थल ढूँढें
अपना टारगेट अनुक्रम CRISPR गाइड फ़ाइंडर में चिपकाएँ। यह दोनों स्ट्रैंड के हर स्थल को स्थिति, स्ट्रैंड और GC मात्रा के साथ बताता है, NGG और दूसरे PAM के लिए। कट के आसपास स्क्रीनिंग डाइजेस्ट की योजना के लिए प्रतिबंधन मैप इस्तेमाल करें।