ガイドに必要なもの
一般的なSpCas9では、ガイドは標的DNAと一致する20塩基で、標的の直後の同じ鎖にNGGのPAMが必要です。Cas9はPAMの3塩基手前で切断します。PAM自体はガイドに含めません。
部位はどちらの鎖にもありえます。下側の鎖のNGGは、上側の鎖ではCCNとして見えます。
部位の選び方
- 位置。遺伝子ノックアウトなら、すべての転写産物に共通する早いエキソンを狙い、フレームシフトでタンパク質を壊します。精密な編集なら、切断位置を変異から約10塩基以内にします。
- GC含量は40〜80%。低すぎると結合が弱く、高すぎるとほかの場所にも結合しやすくなります。
- TTTTを含まない。Tが4つ続くと、多くのガイド用プラスミドが使うU6プロモーターからの転写が止まります。
- 先頭のGはU6からの転写を助けます。ない場合は1つ付け加えるプロトコルが多くあります。
オフターゲット
ガイドは数塩基違うだけの部位、特にミスマッチがPAMから遠い部位も切ることがあります。発注前に候補のガイドをゲノム全体検索ツールで調べ、ほかに近い一致がないものを選んでください。
候補部位を探す
標的配列をCRISPRガイド検索に貼り付けると、両方の鎖のすべての部位が位置、鎖、GC含量とともに一覧になります。NGG以外のPAMにも対応しています。切断部位の周りのスクリーニング用消化は制限酵素地図で計画できます。