PCRプライマーの設計とチェックの方法

良いプライマーの条件

• 長さ: 18〜30塩基。
• GC含量: 40〜60%。
• 融解温度: およそ55〜65 °Cで、対になる2本の差は約5 °C以内。
• 3′末端: GかCで終わる(GCクランプ)。ただし最後の5塩基にGとCが4個以上あるのは避けます。
• 避けるもの: 同じ塩基の連続、プライマー自身と対合する部分(ヘアピンやプライマーダイマー)、もう一方のプライマーと対合する部分。

融解温度

最も簡単な式は、AかT1つにつき2 °C、GかC1つにつき4 °Cを足すもので、短いプライマーにしか向きません。長いプライマーは、GC含量に基づく式や塩濃度補正の式で、最もよいのは最近接塩基対法で見積もります。最近接塩基対法は隣り合う塩基の組をすべて考慮し、プライマー濃度とナトリウム濃度も計算に入れます。

プライマーをチェックする

1. プライマーを1行に1本ずつ、PCR プライマー解析に貼り付けます。
2. 反応液のプライマー濃度とナトリウム濃度を入力します。
3. Tmを比べ、ヘアピン、自己ダイマー、連続塩基、3′末端についての警告を確認します。

産物をチェックする

PCR 産物は、フォワードとリバースのプライマーが鋳型のどこに結合するかを探し、各産物の長さと配列を示します。余分な結合部位があれば、ゲルを流す前に気づけます。プライマーマップは、複数のプライマーを向きを示す矢印とともに配列上に描きます。