良いプライマーの条件
- 長さ: 18〜30塩基。
- GC含量: 40〜60%。
- 融解温度: およそ55〜65 °Cで、対になる2本の差は約5 °C以内。
- 3′末端: GかCで終わる(GCクランプ)。ただし最後の5塩基にGとCが4個以上あるのは避けます。
- 避けるもの: 同じ塩基の連続、プライマー自身と対合する部分(ヘアピンやプライマーダイマー)、もう一方のプライマーと対合する部分。
融解温度
最も簡単な式は、AかT1つにつき2 °C、GかC1つにつき4 °Cを足すもので、短いプライマーにしか向きません。長いプライマーは、GC含量に基づく式や塩濃度補正の式で、最もよいのは最近接塩基対法で見積もります。最近接塩基対法は隣り合う塩基の組をすべて考慮し、プライマー濃度とナトリウム濃度も計算に入れます。
プライマーをチェックする
- プライマーを1行に1本ずつ、PCR プライマー解析に貼り付けます。
- 反応液のプライマー濃度とナトリウム濃度を入力します。
- Tmを比べ、ヘアピン、自己ダイマー、連続塩基、3′末端についての警告を確認します。
産物をチェックする
PCR 産物は、フォワードとリバースのプライマーが鋳型のどこに結合するかを探し、各産物の長さと配列を示します。余分な結合部位があれば、ゲルを流す前に気づけます。プライマーマップは、複数のプライマーを向きを示す矢印とともに配列上に描きます。
プライマーを1本チェックする
5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′を例にします。長さは23塩基で、うち10塩基がGかCなので、GC含量は10 ÷ 23 = 43%となり、40〜60%の範囲に入ります。末尾はGGのGCクランプで、最後の5塩基に含まれるGとCは3つと、一般的な上限ちょうどです。簡易的な2 + 4ルールでは2 × 13 + 4 × 10 = 66 °Cですが、この長さのプライマーでは高めに出ます。塩濃度の条件を入れた最近接塩基対法の計算のほうが信頼できます。
アニーリング温度
一般的な出発点は、ペアのうち低いほうのTmより約3〜5 °C下です。迷ったら、いくつかの温度でグラジエントPCRを行い、きれいなバンドが1本だけ出る温度を選びます。
制限酵素サイトを付ける
産物をクローニングするには、プライマーの5′末端に酵素の認識配列を付け、その手前にさらに4〜6塩基を足して、酵素が末端近くでも切れるようにします。Tmは鋳型に結合する部分だけで計算します。最初のサイクルではテール部分は結合しないからです。
よくある問題
- 産物が出ない。アニーリング温度を下げ、プライマー配列を鋳型と照合し、鋳型が入っていることを確認します。
- バンドが複数出る。アニーリング温度を上げ、プライマーが結合しうる別の場所がないか調べます。
- 100 bpより下に薄いバンドがある。多くはプライマー同士が結合したプライマーダイマーです。3′末端が相補的にならないよう設計し直すか、プライマー濃度を下げます。