ما الذي يجعل البادئة جيدة
- الطول: من 18 إلى 30 قاعدة.
- محتوى GC: من 40 إلى 60%.
- درجة حرارة الانصهار: من نحو 55 إلى 65 °C، مع فرق لا يتجاوز نحو 5 °C بين بادئتي الزوج.
- الطرف ′3: الانتهاء بـ G أو C، أي مشبك GC، لكن دون أكثر من 3 من G أو C في آخر 5 قواعد.
- تجنّب: تكرارات القاعدة نفسها، والمقاطع التي تتزاوج مع البادئة نفسها (الدبابيس وثنائيات البادئات)، والمقاطع التي تتزاوج مع البادئة الأخرى.
درجة حرارة الانصهار
أبسط صيغة تحسب 2 °C لكل A أو T و4 °C لكل G أو C، ولا تكون معقولة إلا للبادئات القصيرة. تُقدَّر البادئات الأطول أفضل بصيغ مبنية على GC مع تصحيح للأملاح، أو أفضل من ذلك بطريقة الجار الأقرب، التي تنظر إلى كل زوج من القواعد المتجاورة وتراعي تركيزي البادئة والصوديوم.
تحقق من بادئاتك
- الصق بادئاتك، واحدة في كل سطر، في تحليل بادئات PCR.
- حدد تركيزي البادئة والصوديوم في تفاعلك.
- قارن قيم Tm واقرأ التنبيهات عن الدبابيس والثنائيات الذاتية والتكرارات أو الطرف ′3.
تحقق من الناتج
يجد نواتج PCR أين ترتبط البادئتان الأمامية والعكسية بالقالب ويعطي حجم كل ناتج وتسلسله، فيظهر موقع ارتباط زائد قبل تشغيل الهلام. وترسم خريطة البادئات مجموعة بادئات على التسلسل بأسهم تبين اتجاهها.
التحقق من بادئ
خذ 5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′. فيه 23 قاعدة، منها 10 من G أو C، فمحتوى GC 10 ÷ 23 = 43%، ضمن نطاق 40 إلى 60%. وينتهي بـ GG، مشبك GC، مع ثلاث G أو C في القواعد الخمس الأخيرة، وهو الحد المعتاد. والقاعدة البسيطة 2 + 4 تعطي 2 × 13 + 4 × 10 = 66 °C، وهي مبالغة لبادئ بهذا الطول. وحساب الجيران الأقرب بظروف الملح لديك أكثر موثوقية.
درجة حرارة التلدين
نقطة بداية شائعة هي نحو 3 إلى 5 °C تحت أدنى Tm في الزوج. وإن كنت مترددًا، فأجرِ PCR متدرجًا بعدة درجات حرارة واختر التي تعطي شريطًا واحدًا نظيفًا.
إضافة موقع تقييد
لاستنساخ الناتج، أضف موقع الإنزيم إلى الطرف 5′ من البادئ، مع 4 إلى 6 قواعد إضافية قبله ليتمكن الإنزيم من القطع قرب الطرف. واحسب الـ Tm بالجزء الذي يرتبط بالقالب فقط، لأن الذيل لا يرتبط في الدورات الأولى.
مشكلات شائعة
- لا ناتج. اخفض درجة حرارة التلدين، وقارن تسلسلات البادئات بالقالب، وتأكد من وجود القالب.
- عدة أشرطة. ارفع درجة حرارة التلدين وابحث عن أماكن أخرى قد ترتبط بها البادئات.
- شريط ضعيف تحت 100 bp. يكون عادةً ثنائي بادئات، أي بادئات مرتبطة ببعضها. أعد تصميمها لتجنب أطراف 3′ متتامة أو اخفض تركيزها.