محاكي PCR
المعادلات في هذه المحاكاة
| N₀ | النسخ الابتدائية من القالب (كأس للعدد 10) | النسخ مزدوجة السلسلة في البداية | |
|---|---|---|---|
| E | الكفاءة E (نسبة القوالب المنسوخة في كل دورة)، % | من 90 إلى 100% في تفاعل جيد؛ وتنخفض هنا حين تكون T_a قريبة جدًا من Tm البادئات، ومع نفاد البادئات والنيوكليوتيدات من التفاعل | |
| n | رقم الدورة | كل دورة: مسخ عند 95 °C، والتحام عند T_a، وتمديد عند 72 °C | |
| N_n | النسخ مزدوجة السلسلة بعد n دورة | تستوي قرب 10¹² نسخة: الهضبة |
بالقيم الحالية:
| النسخ المستهدفة | نواتج بطول الأمبليكون تمامًا | يظهر أولها في الدورة 3؛ وحتى ذلك تمتد السلاسل الجديدة وراء مواقع البادئات (نواتج طويلة)، ولا يزيد عددها إلا 2 في كل دورة، فيفوقها الهدف عددًا سريعًا | |
|---|---|---|---|
| النواتج الطويلة | نسخ فيها سلسلة أطول من الأمبليكون | مصنوعة من سلاسل تمتد وراء موقع بادئ؛ والأعداد تحت الصورة تتبع كل نوع من الجزيئات بدقة |
بالقيم الحالية:
| Tm | درجة انصهار كل بادئ | المعادلة الأساسية للبادئات من 14 قاعدة أو أكثر؛ وحاسبة Tm للبادئات تعطي القيمة الأدق بطريقة الجار الأقرب | |
|---|---|---|---|
| T_a | درجة حرارة الالتحام T_a (°C) | عادةً أقل بـ 3 إلى 5 °C من Tm الأدنى؛ إن كانت أعلى بكثير لا تبقى البادئات مرتبطة، وإن كانت أدنى بكثير ترتبط بأماكن خاطئة | |
| f_b | نسبة البادئات التي تلتحم | 1 ÷ (1 + e^((T_a − Tm) ÷ 1.5))، منحنى انصهار بسيط للبادئ |
بالقيم الحالية:
| L | طول الأمبليكون | بأزواج القواعد، بما فيها البادئات |
|---|
بالقيم الحالية:
كيف تستخدم محاكي PCR
- الصق قالبًا وبادئين، كلاهما مكتوب من ′5 إلى ′3: البادئ الأمامي كما يظهر في القالب، والعكسي كما يظهر في السلسلة الأخرى. يجد المحاكي مواضع ارتباطهما، وطول الأمبليكون، وTm لكل بادئ؛ وافحص زوج بادئات بتفصيل أكثر في حاسبة Tm للبادئات.
- تابع كل دورة في المنظر القريب: عند 95 °C تنفصل السلسلتان، وعند درجة التلدين ترتبط البادئات بمواقعها، وعند 72 °C يمدّ البوليميراز سلسلة جديدة من كل منها. وتحتها يمتلئ الأنبوب بالنسخ: الرمادية التي فيها سلسلة أصلية، والزرقاء النواتج الطويلة التي تتجاوز مواقع البادئات، والخضراء الأمبليكونات المستهدفة بالطول المضبوط.
- اضبط درجة التلدين والكفاءة وعدد النسخ الابتدائية، واقرأ بعد كل دورة العدد الدقيق لكل نوع من النواتج. يبين الرسم النسخ على مقياس لوغاريتمي، حيث التضخيم خط مستقيم ينحني نحو الهضبة. لمعرفة كم نسخة في كتلة معينة من DNA، استخدم حاسبة عدد نسخ DNA ودليلها.
الأسئلة الشائعة
كم نسخة يصنع PCR؟
كل دورة يمكنها على الأكثر مضاعفة DNA، فتعطي n دورة حتى 2ⁿ نسخة لكل قالب: نحو مليار بعد 30 دورة. التفاعلات الحقيقية تعمل بكفاءة 90 إلى 100%، N = N₀ (1 + E)ⁿ، وتستقر قرب 10¹² نسخة حين تنفد البادئات والنيوكليوتيدات.
لماذا تكون النواتج الأولى أطول من الهدف؟
في الدورة الأولى ينسخ كل بادئ السلسلة الأصلية من موقعه حتى نهاية القالب، لأن لا شيء يخبر البوليميراز بالتوقف. ولا تُصنع سلسلة بطول الهدف الدقيق إلا حين يرتبط بادئ بإحدى تلك السلاسل الجديدة، التي تنتهي عند موقع البادئ الآخر. تظهر أولى جزيئات الهدف ثنائية السلسلة في الدورة 3، وبعد 30 دورة تكون كل النواتج تقريبًا: 2ⁿ − 2n لكل قالب، مقابل 2n من النواتج الطويلة.
كيف أختار درجة التلدين؟
ابدأ تحت أدنى Tm من البادئين بـ 3 إلى 5 °C. إن كانت أسخن مما ينبغي فلن تبقى البادئات مرتبطة، فتنهار الكفاءة، كما يبين المحاكي؛ وإن كانت أبرد ارتبطت أيضًا بمواقع تطابق جزئيًا، فتظهر حزم زائدة في الهلام. وPCR متدرج عند عدة درجات يجد الأفضل.
ما Ct في qPCR؟
في PCR الكمي تُبلغ صبغة فلورية عن DNA أثناء تكوّنه، وCt هي الدورة التي تعبر فيها الإشارة عتبة محددة، مثل الخط المتقطع في الرسم. كل قالب أكبر بعشر مرات يعبرها قبل ذلك بنحو 3.3 دورة، وهكذا يقيس qPCR الكمية الموجودة. حاسبة ΔΔCt تحوّل قيم Ct إلى تغيرات في التعبير.
تقول إن WebGL معطّل.
يحتاج العرض ثلاثي الأبعاد إلى WebGL، وهو موجود في كل المتصفحات الحالية. قد يكون معطّلًا إن كان تسريع العتاد مطفأً في إعدادات المتصفح، أو بسبب برنامج تشغيل رسومي قديم جدًا. فعّل تسريع العتاد أو جرّب متصفحًا آخر.
هل يُرفع أي شيء؟
لا. يرسم متصفحك نفسه المحاكاة بـ WebGL؛ لا يُرسل شيء إلى أي مكان، وتستمر في العمل دون اتصال بعد تحميل الصفحة.