كيف تحسب عدد نسخ DNA

الصيغة

النسخ = (الكتلة بالـ ng × 6.022 × 10²³) ÷ (الطول بالـ bp × 660 × 10⁹)

660 g/mol هي متوسط كتلة زوج قواعد من DNA مزدوج السلسلة (نحو 330 لكل قاعدة في DNA أحادي السلسلة و340 في RNA)، و6.022 × 10²³ عدد أفوغادرو، و10⁹ يحوّل النانوغرامات إلى غرامات. كلما طال الجزيء، قلّ عدد النسخ في النانوغرام.

مثال محلول

كم جزيئًا في 1 ng من بلازميد طوله 5,000 bp؟

1. الكتلة المولية: 5,000 × 660 = 3.3 × 10⁶ g/mol.
2. المولات: 1 × 10⁻⁹ g ÷ 3.3 × 10⁶ g/mol = 3.03 × 10⁻¹⁶ mol.
3. النسخ: 3.03 × 10⁻¹⁶ × 6.022 × 10²³ = 1.8 × 10⁸ نسخة.

قاعدة عملية: 1 ng من قطعة 1 kb يساوي نحو 9 × 10⁸ نسخة، و1 ng من 1 bp سيساوي 9 × 10¹¹، فاقسم على الطول بالـ bp.

من النسخ إلى الكتلة

بإعادة الترتيب: الكتلة (ng) = النسخ × الطول × 660 × 10⁹ ÷ 6.022 × 10²³. لـ 10⁶ نسخة من البلازميد نفسه: 10⁶ × 5,000 × 660 × 10⁹ ÷ 6.022 × 10²³ = 5.5 × 10⁻³ ng، أي 5.5 pg.

منحنى معياري للـ qPCR

يحتاج القياس الكمي المطلق معايير بعدد نسخ معروف. قِس تركيز البلازميد، وحوّله إلى نسخ لكل µL، وحضّر تخفيفات متسلسلة 1:10 من 10⁸ مثلًا إلى 10² نسخة لكل µL. شغّلها مع العينات؛ يجب أن يكون رسم Ct مقابل لوغاريتم النسخ خطًا مستقيمًا ميله قريب من −3.3 (كفاءة 100%). البلازميد المخطَّط يعطي معايير أدق من الفائق الالتفاف، وحامل مثل tRNA أو RNA الخميرة يمنع التخفيفات القليلة النسخ من الالتصاق بجدران الأنبوب.

الحاسبات

تحوّل حاسبة عدد نسخ DNA بين النانوغرامات والنسخ لـ DNA أو RNA بأي طول. احصل على التركيز من قراءة A260 بـ حاسبة تركيز DNA؛ وللقياس الكمي النسبي بدلًا من المطلق، استخدم حاسبة ΔΔCt.