لماذا تمتص البروتينات عند 280 nm
يمتص التريبتوفان والتيروسين الضوء فوق البنفسجي عند 280 nm، وتساهم الروابط ثنائية الكبريتيد قليلًا. ولأن كمية كل منها تختلف بين البروتينات، لكل بروتين معامل انطفاء خاص به، وقراءة A280 جيدة بقدر المعامل الذي تستخدمه.
الصيغة
وفق قانون بير-لامبرت، التركيز (M) = A280 ÷ (ε × طول المسار الضوئي)، حيث ε معامل الانطفاء المولي بوحدة M−1 cm−1. اضرب في الوزن الجزيئي لتحصل على mg/mL. واختصار ذلك Abs 0.1%، امتصاصية محلول بتركيز 1 mg/mL، وهي ε ÷ الوزن الجزيئي: mg/mL = A280 ÷ Abs 0.1%.
معامل الانطفاء من التسلسل
طريقة Pace وزملائه (1995) تعدّ البقايا الماصة:
ε = 5500 × Trp + 1490 × Tyr + 125 × السيستينات
السيستين (cystine) زوج من السيستئينات مرتبطين برابطة ثنائية الكبريتيد؛ احذف هذا الحد إن كان البروتين مختزلًا.
مثال محلول
لألبومين مصل البقر ε = 43,824 M−1 cm−1 ووزن جزيئي 66,430 Da، فـ Abs 0.1% له 43,824 ÷ 66,430 = 0.66. قراءة 0.33 في كوفيت 1 cm تساوي 0.33 ÷ 0.66 = 0.5 mg/mL، أو 7.5 µM.
أخطاء شائعة
- صفّر الجهاز بالمحلول المنظِّم نفسه الذي فيه البروتين؛ الإيميدازول والمنظفات وبعض المختزلات تمتص عند 280 nm.
- التلوث بالأحماض النووية يرفع A280. للبروتين النقي نسبة A260/A280 نحو 0.6؛ والقيم القريبة من 1 أو أكثر تدل على DNA أو RNA.
- التكتلات تشتت الضوء وتعطي قراءات مرتفعة. اطرد مركزيًا أو رشّح العينات العكرة.
- أبقِ القراءات بين 0.1 و1.0، مع التخفيف عند الحاجة.
- البروتينات الخالية من التريبتوفان والتيروسين لا تُقاس هكذا؛ استخدم اختبار Bradford أو BCA.
الحاسبات
تحسب حاسبة تركيز البروتين (A280) معامل الانطفاء من تسلسل ملصق، أو تستخدم معاملًا معروفًا أو Abs 0.1%، وتعطي mg/mL وµM. وتحل حاسبة قانون بير-لامبرت المعادلة العامة، ويعطي الوزن الجزيئي للبروتين الكتلة من تسلسل.