الصيغة
الحيوية (%) = الخلايا الحية ÷ (الخلايا الحية + الخلايا الميتة) × 100
عُدّ الحية والميتة في المربعات نفسها، كي يُلغي التخفيف وحجم الحجرة بعضهما؛ فالحيوية نسبة ولا حاجة لتحويلها إلى خلايا لكل mL.
كيف يعمل أزرق التريبان
لا يعبر أزرق التريبان غشاء خلية سليمًا. الخلايا الحية تستبعده وتبدو لامعة تحت المجهر؛ والميتة، ذات الغشاء التالف، تمتصه وتصطبغ بالأزرق. اخلط الخلايا مع أزرق التريبان 0.4% بنسبة 1:1، وانتظر بضع دقائق على الأكثر ثم عُدّ: الصبغة سامة، وبعد نحو 5 دقائق تبدأ الخلايا الحية أيضًا بالاصطباغ، فتبدو الحيوية أسوأ مما هي.
مثال محلول
تعطي أربعة مربعات كبيرة أعداد حية 58 و62 و55 و61 (المتوسط 59) وميتة 6 و8 و5 و9 (المتوسط 7).
- الحيوية = 59 ÷ (59 + 7) × 100 = 89%.
- الخلايا الحية لكل mL = 59 × 2 (تخفيف أزرق التريبان) × 104 = 1.18 × 106.
استخدم عدد الحية، لا الإجمالي، حين تحسب كم تزرع.
ما المقبول
المزارع السليمة في الطور اللوغاريتمي تتجاوز 90% حيوية، ومعظم التجارب تشترط 85 إلى 90% على الأقل. الخلايا المذابة حديثًا قد تكون عند 60 أو 80% وتتعافى بعد تمرير. والخلايا المفصولة بالتربسين تفقد بضع نقاط؛ والتي تبقى طويلًا في التربسين، أو تُسحب بالماصة بعنف، أو تُترك ساعة على الثلج تفقد أكثر. وانخفاض الحيوية بين التمريرات علامة مبكرة على تلوث أو وسط مستنفد أو مشكلة في الحاضنة.
أخطاء شائعة
- عدّ الحطام والشظايا المصطبغة كخلايا ميتة يخفض الرقم؛ وعدّ الخلايا الباهتة المنتفخة كحية يرفعه.
- الخلايا الميتة تتحلل وتختفي في المزرعة، فعدّ الحيوية لا يبيّن إلا الموت الحديث، لا كل ما مات.
- لا يكشف أزرق التريبان الخلايا في بداية الاستماتة، فهي لا تزال تستبعد الصبغة؛ استخدم الأنكسين V أو صبغة مثل يوديد البروبيديوم مع قياس التدفق الخلوي حين يهم ذلك.
الحاسبات
تأخذ حاسبة عدّاد الكريات أعداد الحية والميتة وتعطي الحيوية والخلايا الحية لكل mL. وتحسب حاسبة زرع الخلايا كم تسحب بالماصة، وتتابع حاسبة زمن تضاعف الخلايا النمو بين التمريرات.