Как рассчитать жизнеспособность клеток

Формула

жизнеспособность (%) = живые клетки ÷ (живые клетки + мёртвые клетки) × 100

Считайте живые и мёртвые клетки в одних и тех же квадратах, тогда разведение и объём камеры сокращаются; жизнеспособность — это отношение, и пересчитывать её в клетки на мл не нужно.

Как работает трипановый синий

Трипановый синий не проходит через целую клеточную мембрану. Живые клетки его не пропускают и остаются светлыми под микроскопом; мёртвые клетки с повреждённой мембраной поглощают его и становятся синими. Смешайте клетки с 0,4% трипановым синим 1:1, подождите не больше нескольких минут и считайте: краситель токсичен, и примерно через 5 минут начинают окрашиваться и живые клетки, из-за чего жизнеспособность выглядит хуже, чем есть.

Разобранный пример

В четырёх больших квадратах насчитали живых 58, 62, 55 и 61 (в среднем 59) и мёртвых 6, 8, 5 и 9 (в среднем 7).

• Жизнеспособность = 59 ÷ (59 + 7) × 100 = 89%.
• Живых клеток на мл = 59 × 2 (разведение трипановым синим) × 10⁴ = 1,18 × 10⁶.

Когда считаете, сколько сеять, берите число живых клеток, а не общее.

Что приемлемо

Здоровые культуры в логарифмической фазе имеют жизнеспособность выше 90%, и большинству экспериментов нужно хотя бы 85–90%. Только что размороженные клетки могут иметь 60–80% и восстанавливаются после пассажа. Клетки, снятые трипсином, теряют несколько процентов; клетки, слишком долго пробывшие в трипсине, грубо пипетированные или час продержанные на льду, теряют больше. Падение жизнеспособности между пассажами — ранний признак контаминации, истощённой среды или неполадки инкубатора.

Частые ошибки

• Если считать мусор и окрашенные фрагменты мёртвыми клетками, число занижается; если считать тусклые набухшие клетки живыми — завышается.
• Мёртвые клетки в культуре лизируются и исчезают, поэтому подсчёт жизнеспособности показывает только недавнюю гибель, а не всё, что погибло.
• Трипановый синий не видит клетки в ранней стадии апоптоза, которые ещё не пропускают краситель; если это важно, используйте аннексин V или краситель вроде йодида пропидия с проточной цитометрией.

Калькуляторы

Калькулятор камеры Горяева принимает подсчёты живых и мёртвых и даёт жизнеспособность и живые клетки на мл. Калькулятор посева клеток считает, сколько пипетировать, а Калькулятор времени удвоения клеток отслеживает рост между пассажами.