Чем праймеры для qPCR отличаются от праймеров для ПЦР
qPCR измеряет, как быстро продукт накапливается от цикла к циклу, поэтому праймеры должны копировать мишень с эффективностью, близкой к 100%, и давать только один продукт. Для этого нужны короткие ампликоны и более строгие правила, чем в ПЦР для клонирования, где годится любое количество нужной полосы. Общие правила — в руководстве Как подобрать и проверить праймеры для ПЦР; здесь — то, что меняется для qPCR.
Правила
- Ампликон: примерно 70–150 п. н. Короткий продукт полностью копируется в каждом цикле, что поддерживает высокую эффективность.
- Длина праймера: 18–25 нуклеотидов.
- Tm: около 58–62 °C, причём у двух праймеров в пределах 1–2 °C друг от друга, рассчитанная для соли и магния вашей мастер-смеси.
- GC-состав: 40–60%, и не больше 3 G или C среди последних 5 нуклеотидов на 3′-конце.
- Избегайте: повторов из 4 и более одинаковых нуклеотидов, особенно G, и участков, которые спариваются с самим праймером или с другим праймером. Праймер-димеры важнее всего с SYBR Green, который светится на любой двухцепочечной ДНК, включая димеры.
Зонды
Гидролизный зонд (TaqMan) связывается между двумя праймерами, и его Tm делают примерно на 5–10 °C выше, чем у праймеров, чтобы он уже был связан, когда праймеры начинают удлиняться. Избегайте G на его 5′-конце рядом с репортерным красителем: G там гасит флуоресценцию.
Измерение мРНК: перекройте экзон-экзонный стык
Для экспрессии генов по кДНК поставьте один праймер поперёк стыка двух экзонов или разместите праймеры в разных экзонах с длинным интроном между ними. Тогда геномная ДНК, оставшаяся в РНК, не даёт продукта или даёт слишком длинный, чтобы хорошо амплифицироваться. Контроль без обратной транскрипции (no-RT) — РНК, прошедшая реакцию без обратной транскриптазы, — показывает, проходит ли ещё геномная ДНК.
Проверьте праймеры до заказа
- Рассчитайте обе Tm в Калькулятор Tm праймеров, указав магний вашей мастер-смеси, часто 3 мМ и больше.
- Найдите шпильки, самодимеры и слабый или «липкий» 3′-конец в Анализ праймеров ПЦР.
- Вставьте матрицу в Продукты ПЦР, чтобы убедиться в единственном продукте ожидаемого размера, и проверьте праймеры по всему геному, например в NCBI Primer-BLAST, чтобы исключить другие мишени.
Проверьте их в лаборатории
Поставьте серию разведений матрицы — пять и более 10-кратных шагов — и постройте Ct против логарифма количества в Калькулятор калибровочной кривой. Наклон даёт эффективность: E = 10−1/наклон − 1. Наклон −3,32 означает 100%, а 90–110% обычно считаются допустимыми. С SYBR Green кривая плавления с одним острым пиком показывает единственный продукт, а контроль без матрицы должен оставаться плоским. Затем рассчитайте относительную экспрессию в Калькулятор ΔΔCt, который использует метод Пфаффла, если эффективности двух пар праймеров различаются.