Как работает гель
SDS покрывает белки отрицательным зарядом пропорционально их длине, поэтому в электрическом поле они движутся сквозь полиакриламидную сетку только в зависимости от размера. У геля два слоя: короткий концентрирующий гель с низким pH и низкой концентрацией, который сжимает каждый образец в тонкую полосу, и разделяющий гель под ним, который разделяет белки.
Выберите концентрацию
- 8%: примерно 40–200 кДа
- 10%: примерно 20–150 кДа
- 12%: примерно 15–100 кДа, распространённый универсальный выбор
- 15%: примерно 10–70 кДа
Концентрирующий гель обычно 4% или 5%.
Зачем каждый компонент
- Акриламид/бис: образует сетку геля; его концентрация задаёт размер пор.
- Tris-HCl: pH 8,8 при 0,375 M в разделяющем геле, pH 6,8 при 0,125 M в концентрирующем. Именно разница pH заставляет образцы концентрироваться.
- SDS: 0,1%, держит белки денатурированными и заряженными.
- ПСА и TEMED: запускают полимеризацию. Добавляйте их последними, потому что гель начинает застывать уже через несколько минут.
Залейте гели
- Соберите стёкла и проверьте их на протечки водой.
- Смешайте разделяющий гель, добавьте ПСА и TEMED, перемешайте и залейте примерно на 1,5 см ниже того места, докуда дойдут зубцы гребёнки.
- Наслоите изопропанол или воду, чтобы край был ровным, и дайте застыть 20–30 минут.
- Слейте наслоение, смешайте концентрирующий гель с ПСА и TEMED, залейте сверху и вставьте гребёнку.
- Дайте застыть, затем выньте гребёнку и промойте лунки.
Неполимеризованный акриламид — нейротоксин: работайте в перчатках и обращайтесь с растворами осторожно.
Калькуляторы
Калькулятор геля для SDS-ПААГ перечисляет все объёмы разделяющего и концентрирующего гелей для любой концентрации и числа гелей. Чтобы нанести равные количества белка, измерьте образцы в Калькулятор концентрации белка (A280).