Что делает калибровочная кривая
Многие методы, такие как Брэдфорд, BCA, ИФА и qPCR, дают показание, которое растёт с концентрацией, но не на фиксированную известную величину. Измерение образцов известной концентрации — стандартов — в том же запуске показывает, как показание связано с концентрацией, а неизвестные образцы считываются по этой связи.
Приготовление стандартов
- Используйте 5–8 стандартов, охватывающих ожидаемый диапазон, включая холостую пробу (ноль).
- Готовьте их в том же буфере, что и образцы, чтобы буфер влиял на те и другие одинаково.
- Готовьте их разведением из одного стока и ставьте в двух-трёх повторностях вместе с образцами.
Подбор прямой
Постройте показание против концентрации и подберите методом наименьших квадратов прямую показание = наклон × концентрация + пересечение. Затем для каждого неизвестного:
концентрация = (показание − пересечение) ÷ наклон
Умножьте на коэффициент разведения, если образец разводили перед измерением.
Разобранный пример
Стандарты БСА 0, 250, 500 и 1000 мкг/мл дают оптические плотности 0,05, 0,37, 0,66 и 1,21. Подобранная прямая — примерно показание = 0,00115 × концентрация + 0,068. Образец, разведённый 1:5, показывает 0,48: (0,48 − 0,068) ÷ 0,00115 = 358 мкг/мл в лунке, или около 1,8 мг/мл в исходном образце.
Оценка кривой
- R² выше примерно 0,99 — обычное дело. Меньшее значение указывает на ошибку пипетирования или выброс.
- Оставайтесь внутри стандартов. Показания выше самого высокого стандарта экстраполированы; разведите образец и измерьте снова.
- Следите за изгибом. Многие методы выходят на плато при высоких концентрациях. Отбросьте верхние стандарты, которые загибаются, или используйте более узкий диапазон.
Калькуляторы
Калькулятор калибровочной кривой подбирает прямую, даёт R² и рассчитывает каждый неизвестный образец с его разведением. Спланируйте стандарты в Калькулятор серийных разведений; для очищенных белков Калькулятор концентрации белка (A280) использует A280 вместо кривой.