検量線の役割
Bradford、BCA、ELISA、qPCRなど多くの測定法では、濃度が上がると測定値も上がりますが、その増え方は一定ではありません。濃度がわかっている試料（標準）を同時に測れば、その回の測定値と濃度の関係がわかり、未知試料をその関係から読み取れます。
標準の準備
- 予想される範囲をカバーする5〜8点の標準を、ブランク（0）を含めて用意します。
- 試料と同じバッファーで作り、バッファーの影響を両方に等しくします。
- 1つのストックから希釈して作り、試料と並べて2〜3重で測ります。
直線を当てはめる
濃度に対して測定値をプロットし、最小二乗法で直線測定値 = 傾き × 濃度 + 切片を当てはめます。各未知試料は次の式で求めます。
濃度 = (測定値 − 切片) ÷ 傾き
測定前に試料を希釈した場合は、希釈倍率を掛けます。
計算例
BSA標準0、250、500、1,000 µg/mLの吸光度が0.05、0.37、0.66、1.21だとします。当てはめた直線はおよそ 測定値 = 0.00115 × 濃度 + 0.068 です。5倍希釈した試料が0.48なら、(0.48 − 0.068) ÷ 0.00115 = ウェル内で358 µg/mL、元の試料では約1.8 mg/mLです。
検量線の確認
- R²は0.99以上が一般的です。低い場合はピペット操作の誤差や外れ値が疑われます。
- 標準の範囲内で使う。最も高い標準より上の測定値は外挿です。試料を希釈して測り直します。
- 曲がりに注意。多くの測定法は高濃度で頭打ちになります。曲がる上の標準を除くか、範囲を狭めます。
計算ツール
検量線の計算は直線を当てはめ、R²を出し、希釈を含めて未知試料をすべて計算します。標準の作成計画には段階希釈の計算を、精製タンパク質なら検量線の代わりにA280を使うタンパク質濃度の計算（A280）を使います。