Wozu eine Standardkurve dient
Viele Tests wie Bradford, BCA, ELISA und qPCR liefern einen Messwert, der mit der Konzentration steigt, aber nicht um einen festen, bekannten Betrag. Wer gleichzeitig Proben bekannter Konzentration, die Standards, misst, sieht, wie Messwert und Konzentration in diesem Lauf zusammenhängen, und liest unbekannte Proben daran ab.
Standards ansetzen
- Nimm 5 bis 8 Standards, die den erwarteten Bereich abdecken, einschließlich eines Leerwerts (null).
- Setze sie im selben Puffer wie die Proben an, damit der Puffer beide gleich beeinflusst.
- Stelle sie durch Verdünnung aus einer Stammlösung her und miss sie doppelt oder dreifach neben den Proben.
Die Gerade anpassen
Trage den Messwert gegen die Konzentration auf und lege mit der Methode der kleinsten Quadrate eine Gerade hindurch: Messwert = Steigung × Konzentration + Achsenabschnitt. Für jede Probe gilt dann:
Konzentration = (Messwert − Achsenabschnitt) ÷ Steigung
Multipliziere mit dem Verdünnungsfaktor, wenn die Probe vor der Messung verdünnt wurde.
Ein Rechenbeispiel
BSA-Standards mit 0, 250, 500 und 1.000 µg/mL ergeben Extinktionen von 0,05, 0,37, 0,66 und 1,21. Die angepasste Gerade ist etwa Messwert = 0,00115 × Konzentration + 0,068. Eine 1:5 verdünnte Probe misst 0,48: (0,48 − 0,068) ÷ 0,00115 = 358 µg/mL im Well, also etwa 1,8 mg/mL in der Ausgangsprobe.
Die Kurve beurteilen
- R² über etwa 0,99 ist üblich. Ein niedrigerer Wert deutet auf einen Pipettierfehler oder einen Ausreißer.
- Bleib innerhalb der Standards. Messwerte über dem höchsten Standard sind extrapoliert; verdünne die Probe und miss neu.
- Achte auf Krümmung. Viele Tests flachen bei hohen Konzentrationen ab. Lass die oberen Standards weg, die abknicken, oder nimm einen engeren Bereich.
Rechner
Der Standardkurven-Rechner passt die Gerade an, gibt R² aus und berechnet jede Probe mit ihrer Verdünnung. Plane die Standards mit dem Verdünnungsreihen-Rechner; für gereinigte Proteine nutzt der Rechner Proteinkonzentration berechnen (A280) die A280 statt einer Kurve.