À quoi sert une courbe étalon
Beaucoup de dosages, comme Bradford, BCA, ELISA et qPCR, donnent une mesure qui augmente avec la concentration, mais pas d’une quantité fixe et connue. Mesurer en même temps des échantillons de concentration connue, les étalons, montre le lien entre mesure et concentration dans cette série, et les échantillons inconnus se lisent sur ce lien.
Préparer les étalons
- Utilisez 5 à 8 étalons couvrant la gamme attendue, dont un blanc (zéro).
- Préparez-les dans le même tampon que les échantillons, pour que le tampon agisse de la même façon sur les deux.
- Obtenez-les par dilution d’un même stock et mesurez-les en double ou en triple à côté des échantillons.
Ajuster la droite
Tracez la mesure en fonction de la concentration et ajustez une droite, mesure = pente × concentration + ordonnée à l’origine, par les moindres carrés. Puis, pour chaque échantillon :
concentration = (mesure − ordonnée à l’origine) ÷ pente
Multipliez par le facteur de dilution si l’échantillon a été dilué avant la mesure.
Un exemple
Des étalons de BSA à 0, 250, 500 et 1 000 µg/mL donnent des absorbances de 0,05, 0,37, 0,66 et 1,21. La droite ajustée vaut environ mesure = 0,00115 × concentration + 0,068. Un échantillon dilué au 1/5 mesure 0,48 : (0,48 − 0,068) ÷ 0,00115 = 358 µg/mL dans le puits, soit environ 1,8 mg/mL dans l’échantillon de départ.
Juger la courbe
- Un R² supérieur à environ 0,99 est la norme. Une valeur plus basse signale une erreur de pipetage ou un point aberrant.
- Restez dans la gamme des étalons. Au-dessus de l’étalon le plus haut, on extrapole ; diluez l’échantillon et mesurez à nouveau.
- Surveillez la courbure. Beaucoup de dosages saturent aux fortes concentrations. Retirez les étalons du haut qui s’écartent, ou réduisez la gamme.
Calculateurs
Le calcul de courbe étalon ajuste la droite, donne le R² et calcule chaque échantillon avec sa dilution. Préparez les étalons avec le calcul de dilution en série ; pour des protéines purifiées, le calcul de la concentration en protéines utilise l’A280 au lieu d’une courbe.