Ce que signifie le Tm
La température de fusion (Tm) est la température à laquelle la moitié de l’amorce est liée à sa cible et l’autre moitié libre. L’étape d’hybridation de la PCR est réglée un peu en dessous, pour que les amorces se fixent fermement mais seulement au bon endroit.
Trois façons de le calculer
- La règle de Wallace, pour les amorces de moins d’environ 14 bases : Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). Rapide, mais elle ignore l’ordre des bases et le tampon.
- La formule du GC, pour les amorces plus longues : Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) ÷ longueur. Un 20-mère avec 10 G ou C donne 64,9 + 41 × (10 − 16,4) ÷ 20 = 51,8 °C.
- La thermodynamique des plus proches voisins, la plus précise : elle additionne l’énergie d’empilement de chaque paire de bases voisines, puis corrige selon la concentration d’amorce et le sel du mélange.
Pourquoi le tampon compte
Les cations neutralisent la charge négative du squelette de l’ADN : plus de sel, c’est un Tm plus élevé. Le magnésium agit bien plus que le sodium, et les dNTP en captent une partie. La même amorce peut varier de 5 °C ou plus entre des calculateurs qui supposent des tampons différents ; indiquez donc les concentrations de sodium, de magnésium et de dNTP de votre propre mélange.
Choisir la température d’hybridation
Partez d’environ 5 °C sous le plus bas des deux Tm. Sans produit, baissez-la ; avec des bandes en trop, montez-la. Une PCR en gradient teste une plage en un seul passage. Certaines polymérases haute fidélité ont leurs propres règles de fabricant pour leur tampon, qui peuvent donner un autre point de départ.
Règles de conception
- 18 à 25 bases, avec 40 % à 60 % de GC.
- Les Tm des deux amorces à moins d’environ 5 °C l’un de l’autre.
- Un G ou un C à l’extrémité 3’, mais pas plus de 3 G ou C dans les 5 dernières bases.
- Pas de suites de 4 bases identiques ou plus, ni de segments qui s’apparient avec eux-mêmes ou avec l’autre amorce.
Calculateurs
Le calcul du Tm d’amorces utilise la thermodynamique des plus proches voisins avec vos concentrations de sel, de magnésium et d’amorce, et propose une température d’hybridation. Statistiques d’amorces PCR compare les trois méthodes et signale épingles, autodimères et répétitions.