프라이머 Tm과 어닐링 온도 구하는 방법

Tm이란

녹는 온도(Tm)는 프라이머의 절반이 표적에 붙어 있고 절반이 떨어져 있는 온도입니다. PCR의 어닐링 단계는 이보다 조금 낮게 설정해 프라이머가 단단히, 하지만 올바른 자리에만 붙게 합니다.

세 가지 계산 방법

• Wallace 규칙(약 14염기 미만의 프라이머): Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). 빠르지만 염기 순서와 버퍼를 고려하지 않습니다.
• GC 공식(더 긴 프라이머): Tm = 64.9 + 41 × (G + C − 16.4) ÷ 길이. G나 C가 10개인 20mer는 64.9 + 41 × (10 − 16.4) ÷ 20 = 51.8 °C입니다.
• 최근접 이웃 열역학(가장 정확): 이웃한 염기쌍마다의 쌓임 에너지를 더한 뒤 프라이머 농도와 반응액의 염으로 보정합니다.

버퍼가 중요한 이유

양이온이 DNA 골격의 음전하를 가리므로 염이 많을수록 Tm이 높아집니다. 마그네슘은 나트륨보다 영향이 훨씬 크고, dNTP가 그 일부와 결합합니다. 가정하는 버퍼가 다르면 같은 프라이머도 계산기마다 5 °C 이상 차이가 날 수 있으니, 자신의 반응액 나트륨, 마그네슘, dNTP 농도를 입력하세요.

어닐링 온도 고르기

두 프라이머 중 낮은 Tm보다 약 5 °C 낮은 온도에서 시작합니다. 산물이 없으면 낮추고, 원치 않는 밴드가 보이면 올립니다. 그래디언트 PCR로 한 번에 범위를 시험할 수 있습니다. 일부 고정확도 중합효소는 전용 버퍼에 맞는 제조사 기준이 있어 시작점이 다를 수 있습니다.

프라이머 설계 기준

• 길이 18~25염기, GC 40~60%.
• 두 프라이머의 Tm 차이는 약 5 °C 이내.
• 3' 말단은 G나 C로 하되, 마지막 5염기 중 G나 C는 3개까지.
• 같은 염기가 4개 이상 이어지지 않고, 자기 자신이나 다른 프라이머와 짝을 이루는 구간이 없을 것.

계산기

프라이머 Tm 계산기는 입력한 염, 마그네슘, 프라이머 농도로 최근접 이웃 열역학 계산을 하고 어닐링 온도를 제안합니다. PCR 프라이머 통계는 세 방법을 비교하고 헤어핀, 자기 이합체, 연속 염기를 경고합니다.