몰비로 생각하는 이유
라이게이션 효율은 질량이 아니라 DNA 말단의 수로 정해집니다. 작은 인서트는 큰 벡터보다 ng당 분자 수가 훨씬 많아서, 같은 질량이면 분자 수가 크게 달라집니다. 그래서 프로토콜은 인서트와 벡터의 몰비를 정하며, 가장 흔히 쓰는 것은 3:1입니다.
공식
인서트(ng) = 벡터(ng) × 인서트 길이 ÷ 벡터 길이 × 비율
3,000 bp 벡터 50 ng과 1,000 bp 인서트를 3:1로 쓴다면 50 × 1,000 ÷ 3,000 × 3 = 50 ng의 인서트입니다.
요령
- 처음에 콜로니가 적으면 1:1, 3:1, 5:1을 시도하세요.
- 어닐링한 올리고처럼 아주 짧은 인서트는 높은 비율이 필요한 경우가 많습니다.
- 덜 잘렸거나 자기 연결된 벡터로 인한 배경을 확인하려면 벡터만 넣은 라이게이션을 대조군으로 두세요.
- 농도는 정제 전이 아니라 정제 뒤에 재세요.
계산 도구
라이게이션 계산기는 어떤 비율이든 인서트 ng 수를 보여 주고, 인서트 농도를 넣으면 피펫으로 덜 양도 알 수 있습니다. 그 농도는 DNA 농도 계산기로 구할 수 있습니다.
부피까지 포함한 예
위 예에서는 벡터 50 ng과 인서트 50 ng이 필요합니다. 벡터가 50 ng/µL, 인서트가 25 ng/µL라면 다음과 같습니다.
- 벡터: 50 ÷ 50 = 1 µL
- 인서트: 50 ÷ 25 = 2 µL
- 10× 라이게이스 버퍼: 2 µL, T4 DNA 라이게이스: 1 µL
- 물로 20 µL 맞추기: 14 µL
몰로 확인하기
이중 가닥 DNA 염기쌍 하나는 약 650 g/mol이므로 pmol = ng × 1,000 ÷ (bp × 650)입니다. 벡터는 50,000 ÷ (3,000 × 650) ≈ 0.026 pmol, 인서트는 50,000 ÷ (1,000 × 650) ≈ 0.077 pmol로 정확히 세 배입니다.
콜로니가 적거나 없을 때
- 라이게이스 버퍼의 ATP는 얼렸다 녹이기를 반복하면 분해됩니다. 버퍼는 조금씩 나눠 보관하세요.
- 평활 말단은 점착 말단보다 훨씬 잘 연결되지 않습니다. 라이게이스를 늘리고 반응 시간을 길게 하세요.
- 탈인산화한 벡터에는 5′ 인산이 남아 있는 인서트가 필요합니다. 일반 프라이머로 만든 PCR 산물에는 없습니다.