몰비로 생각하는 이유
라이게이션 효율은 질량이 아니라 DNA 말단의 수로 정해집니다. 작은 인서트는 큰 벡터보다 ng당 분자 수가 훨씬 많아서, 같은 질량이면 분자 수가 크게 달라집니다. 그래서 프로토콜은 인서트와 벡터의 몰비를 정하며, 가장 흔히 쓰는 것은 3:1입니다.
공식
인서트(ng) = 벡터(ng) × 인서트 길이 ÷ 벡터 길이 × 비율
3,000 bp 벡터 50 ng과 1,000 bp 인서트를 3:1로 쓴다면 50 × 1,000 ÷ 3,000 × 3 = 50 ng의 인서트입니다.
요령
- 처음에 콜로니가 적으면 1:1, 3:1, 5:1을 시도하세요.
- 어닐링한 올리고처럼 아주 짧은 인서트는 높은 비율이 필요한 경우가 많습니다.
- 덜 잘렸거나 자기 연결된 벡터로 인한 배경을 확인하려면 벡터만 넣은 라이게이션을 대조군으로 두세요.
- 농도는 정제 전이 아니라 정제 뒤에 재세요.
계산 도구
라이게이션 계산기는 어떤 비율이든 인서트 ng 수를 보여 주고, 인서트 농도를 넣으면 피펫으로 덜 양도 알 수 있습니다. 그 농도는 DNA 농도 계산기로 구할 수 있습니다.