একটি মোলার অনুপাত কেন
লাইগেশন নির্ভর করে DNA-র প্রান্তের সংখ্যার ওপর, তাদের ভরের ওপর নয়। একটি ছোট ইনসার্টের প্রতি ng-এ একটি বড় ভেক্টরের চেয়ে অনেক বেশি অণু থাকে, তাই সমান ভর নিলে অণুর সংখ্যা খুবই অসমান হয়ে যেত। তাই পদ্ধতিগুলো ইনসার্ট আর ভেক্টরের একটি মোলার অনুপাত দেয়, সবচেয়ে বেশি 3:1।
সূত্রটি
ইনসার্ট (ng) = ভেক্টর (ng) × ইনসার্টের দৈর্ঘ্য ÷ ভেক্টরের দৈর্ঘ্য × অনুপাত
একটি 3,000 bp ভেক্টরের 50 ng আর একটি 1,000 bp ইনসার্ট নিয়ে 3:1-এ: 50 × 1,000 ÷ 3,000 × 3 = ইনসার্টের 50 ng।
টুকরো পরামর্শ
- প্রথম চেষ্টায় কম কলোনি এলে 1:1, 3:1 আর 5:1 দেখে নিন।
- খুব ছোট ইনসার্টে, যেমন জোড়া বাঁধানো অলিগোতে, প্রায়ই বেশি অনুপাত দরকার হয়।
- না-কাটা কিংবা নিজের সঙ্গে জোড়া লাগা ভেক্টরের পটভূমি ধরতে কেবল-ভেক্টরের একটি লাইগেশন নিয়ন্ত্রণ হিসেবে রাখুন।
- ঘনমাত্রা মাপুন শোধনের পরে, আগে নয়।
হিসাব
লাইগেশনের হিসাব যেকোনো অনুপাতের জন্য ইনসার্টের ng দেয়, আর ইনসার্টের ঘনমাত্রা দিলে পিপেট করার আয়তনও। ওই ঘনমাত্রা মাপুন DNA-র ঘনমাত্রার হিসাব দিয়ে।
আয়তন নিয়ে একটি কষে দেখানো উদাহরণ
ওপরের উদাহরণ থেকে আপনার দরকার 50 ng ভেক্টর আর 50 ng ইনসার্ট। ভেক্টরটি 50 ng/µL-এ আর ইনসার্টটি 25 ng/µL-এ হলে:
- ভেক্টর: 50 ÷ 50 = 1 µL।
- ইনসার্ট: 50 ÷ 25 = 2 µL।
- 10× লাইগেজের বাফার: 2 µL। T4 DNA লাইগেজ: 1 µL।
- 20 µL পর্যন্ত পানি: 14 µL।
মোলে তা মিলিয়ে দেখা
দুই-সূত্রক DNA-র একটি বেস জোড়ার ওজন প্রায় 650 g/mol, তাই pmol = ng × 1,000 ÷ (bp × 650)। ভেক্টরটি 50,000 ÷ (3,000 × 650) ≈ 0.026 pmol আর ইনসার্টটি 50,000 ÷ (1,000 × 650) ≈ 0.077 pmol, অর্থাৎ তিন গুণ বেশি।
অল্প কিংবা কোনো কলোনি নেই
- লাইগেজের বাফারের ATP বারবার জমানো আর গলানোয় ভেঙে যায়। বাফারটি ছোট ভাগে রেখে দিন।
- ভোঁতা প্রান্ত আঠালো প্রান্তের চেয়ে অনেক কম সহজে জোড়া লাগে; বেশি লাইগেজ আর একটি লম্বা সময় নিন।
- ফসফেট-সরানো একটি ভেক্টরে এমন একটি ইনসার্ট দরকার যার 5′ ফসফেট তখনো আছে; সাধারণ প্রাইমারে বানানো PCR উৎপাদে তা নেই।