ΔΔCt দিয়ে qPCR-র গুণ বদল কীভাবে বের করবেন

আপনার যা দরকার

একটি লক্ষ্য জিন আর একটি সূত্র জিনের (একটি ঘরকন্নার জিন, যেমন GAPDH কিংবা ACTB, যার প্রকাশ চিকিৎসায় বদলায় না) Ct মান, যা একটি চিকিৎসা-পাওয়া আর একটি নিয়ন্ত্রণ নমুনায় মাপা।

তিনটি ধাপ

1. প্রতিটি নমুনাকে সূত্র জিনের সাপেক্ষে সমান করুন: ΔCt = Ct লক্ষ্য − Ct সূত্র।
2. চিকিৎসা-পাওয়াকে নিয়ন্ত্রণের সঙ্গে মিলিয়ে দেখুন: ΔΔCt = ΔCt চিকিৎসা-পাওয়া − ΔCt নিয়ন্ত্রণ।
3. গুণ বদলে বদলান: গুণ বদল = 2^−ΔΔCt।

একটি কষে দেখানো উদাহরণ

চিকিৎসা-পাওয়া: লক্ষ্যের Ct 22.1, সূত্রের Ct 18.0, তাই ΔCt = 4.1। নিয়ন্ত্রণ: লক্ষ্যের Ct 24.5, সূত্রের Ct 18.0, তাই ΔCt = 6.5।

ΔΔCt = 4.1 − 6.5 = −2.4, আর গুণ বদল = 2^2.4 = 5.3। চিকিৎসা-পাওয়া নমুনায় লক্ষ্যটির প্রকাশ প্রায় 5.3 গুণ বেশি। 1-র নিচে একটি গুণ বদল মানে কম প্রকাশ; 0.5 মানে অর্ধেক।

2^-ΔΔCt কখন যথেষ্ট নয়

উপায়টি ধরে নেয় দুটি প্রাইমার-জোড়াই 100% দক্ষতার কাছাকাছি, অর্থাৎ প্রতি চক্রে উৎপাদ দ্বিগুণ করে। একটি আদর্শ বাঁক দিয়ে তা পরখ করুন; 90% থেকে 110%-ই চলতি পরিসর। দক্ষতা আলাদা হলে Pfaffl উপায় নিন, যা প্রতিটি জিনের নিজের দক্ষতা হিসাবে ঢুকিয়ে দেয়: অনুপাত = E_{লক্ষ্য}^{ΔCt লক্ষ্য} ÷ E_{সূত্র}^{ΔCt সূত্র}, যেখানে প্রতিটি ΔCt হলো নিয়ন্ত্রণ থেকে চিকিৎসা-পাওয়া বাদ আর E = 1 + দক্ষতা।

পুনরাবৃত্তি আর পরিসংখ্যান

• ΔCt বের করার আগে কারিগরি পুনরাবৃত্তির (একই নমুনার কুয়োগুলোর) গড় নিন।
• পরিসংখ্যান চালান জৈব পুনরাবৃত্তির ΔCt কিংবা ΔΔCt মানের ওপরে, গুণ বদলের ওপরে নয়, কারণ গুণ বদল স্বাভাবিকভাবে ছড়ানো নয়।
• ওপরে আর নিচে নিয়ন্ত্রণ একই মাপকাঠিতে চাইলে log₂ গুণ বদলই জানান, যা সরাসরি −ΔΔCt।

হিসাব

ΔΔCt-র হিসাব পুনরাবৃত্ত Ct মানের গড় নেয়, ΔCt, ΔΔCt, গুণ বদল আর log₂ গুণ বদল দেয়, আর প্রাইমারের দক্ষতা লিখলে Pfaffl উপায়ে চলে যায়। একটি আদর্শ বাঁক দিয়ে পরম পরিমাপের জন্য DNA-র অনুলিপি সংখ্যার হিসাব প্রতিটি আদর্শে অনুলিপি বের করে দেয়।