PCR সিমুলেটর
এই সিমুলেশনের সমীকরণ
| N₀ | টেমপ্লেটের শুরুর কপি (10-এর ঘাত হিসেবে) | শুরুতে দ্বিসূত্রক কপি | |
|---|---|---|---|
| E | দক্ষতা E (প্রতি চক্রে যত অংশ টেমপ্লেট কপি হয়), % | ভালো বিক্রিয়ায় 90 থেকে 100%; এখানে T_a প্রাইমারের Tm-এর খুব কাছে হলে কমে, আর বিক্রিয়ায় প্রাইমার ও নিউক্লিওটাইড ফুরোতে থাকলেও কমে | |
| n | চক্রের নম্বর | প্রতি চক্র: 95 °C-এ ডিনেচার, T_a-তে অ্যানিল, 72 °C-এ এক্সটেনশন | |
| N_n | n চক্রের পরে দ্বিসূত্রক কপি | প্রায় 10¹² কপির কাছে সমতল হয়ে যায়: প্লাটো |
এখনকার মানগুলো দিয়ে:
| লক্ষ্য কপি | ঠিক অ্যামপ্লিকন দৈর্ঘ্যের উৎপাদ | প্রথমগুলো 3 নম্বর চক্রে আসে; তার আগে নতুন সূত্রকগুলো প্রাইমারের জায়গা ছাড়িয়ে যায় (লম্বা উৎপাদ), আর তাদের সংখ্যা প্রতি চক্রে মাত্র 2 করে বাড়ে, তাই লক্ষ্য শিগগিরই তাদের ছাড়িয়ে যায় | |
|---|---|---|---|
| লম্বা উৎপাদ | অ্যামপ্লিকনের চেয়ে লম্বা সূত্রকসহ কপি | যেসব সূত্রক প্রাইমারের জায়গা ছাড়িয়ে যায় তাদের থেকে তৈরি; ছবির নিচের গণনাগুলো প্রতিটি ধরনের অণু ঠিকঠাক অনুসরণ করে |
এখনকার মানগুলো দিয়ে:
| Tm | প্রতিটি প্রাইমারের গলনাঙ্ক | 14 বা তার বেশি বেসের প্রাইমারের জন্য সাধারণ সূত্র; প্রাইমার Tm ক্যালকুলেটরে আরও নিখুঁত নিয়ারেস্ট-নেইবার মান আছে | |
|---|---|---|---|
| T_a | অ্যানিলিং তাপমাত্রা T_a (°C) | সাধারণত কম Tm-এর 3 থেকে 5 °C নিচে; এর অনেক বেশি হলে প্রাইমার জুড়ে থাকে না, অনেক কম হলে ভুল জায়গায় জুড়ে বসে | |
| f_b | যত অংশ প্রাইমার অ্যানিল করে | 1 ÷ (1 + e^((T_a − Tm) ÷ 1.5)), প্রাইমারের একটি সরল গলন লেখচিত্র |
এখনকার মানগুলো দিয়ে:
| L | অ্যামপ্লিকন দৈর্ঘ্য | বেস পেয়ারে, প্রাইমারসহ |
|---|
এখনকার মানগুলো দিয়ে:
PCR সিমুলেটরটি কীভাবে ব্যবহার করবেন
- একটি টেমপ্লেট আর দুটি প্রাইমার সেঁটে দিন, দুটিই 5′ থেকে 3′ লেখা: সামনের প্রাইমারটি টেমপ্লেটে যেমন আছে তেমন, আর পিছনের প্রাইমারটি অন্য সূত্রকে যেমন আছে তেমন। সিমুলেটরটি খুঁজে নেয় সেগুলো কোথায় জুড়ে বসে, অ্যামপ্লিকনের দৈর্ঘ্য আর প্রতিটি প্রাইমারের Tm; একটি প্রাইমার-জোড়া আরও খুঁটিয়ে দেখতে প্রাইমারের Tm-র হিসাব ব্যবহার করুন।
- প্রতিটি চক্র কাছ থেকে দেখুন: 95 °C-এ দুটি সূত্রক আলাদা হয়ে যায়, অ্যানিলিংয়ের তাপমাত্রায় প্রাইমারগুলো নিজের জায়গায় জুড়ে বসে, আর 72 °C-এ পলিমারেজ প্রত্যেকটি থেকে একটি নতুন সূত্রক বাড়িয়ে নেয়। নিচে নলটি অনুলিপিতে ভরে যায়: ধূসর আসল টেমপ্লেট, নীল লম্বা উৎপাদ, যা প্রাইমারের জায়গা ছাড়িয়ে চলে যায়, আর সবুজ লক্ষ্য অ্যামপ্লিকন, যা ঠিক দরকারি দৈর্ঘ্যের।
- অ্যানিলিংয়ের তাপমাত্রা, দক্ষতা আর শুরুর অনুলিপির সংখ্যা বসিয়ে দিন, আর প্রতিটি চক্রের পর প্রতিটি ধরনের উৎপাদের ঠিক গণনা পড়ে নিন। লেখচিত্রটি অনুলিপিগুলো লগ মাপে আঁকে, যেখানে বর্ধন একটি সরলরেখা, যা গিয়ে সমতলে বেঁকে যায়। একটি নির্দিষ্ট ভরের DNA কতগুলো অনুলিপি তা বের করতে DNA-র অনুলিপি সংখ্যার হিসাব আর তার নির্দেশিকা ব্যবহার করুন।
সাধারণ প্রশ্ন
PCR কতগুলো অনুলিপি বানায়?
প্রতিটি চক্র সবচেয়ে বেশি DNA দ্বিগুণ করতে পারে, তাই n চক্রে প্রতি টেমপ্লেটে 2ⁿ পর্যন্ত অনুলিপি হয়: 30 চক্রের পর প্রায় একশ কোটি। আসল বিক্রিয়া চলে 90 থেকে 100% দক্ষতায়, N = N₀ (1 + E)ⁿ, আর প্রাইমার ও নিউক্লিওটাইড ফুরিয়ে এলে তা প্রায় 10¹² অনুলিপিতে থিতিয়ে যায়।
প্রথম উৎপাদগুলো লক্ষ্যের চেয়ে লম্বা কেন?
প্রথম চক্রে প্রতিটি প্রাইমার আসল সূত্রকটি নিজের জায়গা থেকে টেমপ্লেটের শেষ পর্যন্ত নকল করে, কারণ পলিমারেজকে থামতে বলার কিছুই নেই। কেবল যখন একটি প্রাইমার ওই নতুন সূত্রকগুলোর একটিতে জুড়ে বসে, যা অন্য প্রাইমারের জায়গায় শেষ হয়, তখনই ঠিক লক্ষ্য দৈর্ঘ্যের একটি সূত্রক তৈরি হয়। প্রথম দুই-সূত্রক লক্ষ্য অণু দেখা দেয় 3 নম্বর চক্রে, আর 30 চক্রের পর তারাই উৎপাদের প্রায় সবটাই: প্রতি টেমপ্লেটে 2ⁿ − 2n, আর লম্বা উৎপাদ 2n।
অ্যানিলিংয়ের তাপমাত্রা কীভাবে বেছে নেব?
দুটি প্রাইমারের ছোট Tm-র 3 থেকে 5 °C নিচে শুরু করুন। বেশি গরম হলে প্রাইমারগুলো জুড়ে থাকে না, তাই দক্ষতা ভেঙে পড়ে, যা সিমুলেটরটি দেখিয়ে দেয়; বেশি ঠান্ডা হলে তারা আধা-মেলা জায়গাতেও জুড়ে বসে, আর তাতে একটি জেলে বাড়তি ব্যান্ড পড়ে। কয়েকটি তাপমাত্রাজুড়ে একটি গ্রেডিয়েন্ট PCR সবচেয়ে ভালোটি খুঁজে দেয়।
qPCR-এ Ct কী?
পরিমাণগত PCR-এ একটি প্রতিপ্রভ রং DNA তৈরি হওয়ার সঙ্গে সঙ্গেই তা জানিয়ে দেয়, আর Ct হলো সেই চক্র, যেখানে সংকেতটি একটি বসানো সীমা পার হয়, লেখচিত্রের ছেদরেখাটির মতো। শুরুর টেমপ্লেট দশ গুণ বেশি হলে তা প্রায় 3.3 চক্র আগেই পার হয়, আর qPCR এভাবেই মাপে শুরুতে কতটা ছিল। ΔΔCt-র হিসাব Ct মানগুলোকে গুণ-বদলে বদলে দেয়।
বলছে WebGL বন্ধ আছে।
3D দৃশ্যটির জন্য WebGL দরকার, যা আজকের প্রতিটি ব্রাউজারেই আছে। ব্রাউজারের সেটিংসে হার্ডওয়্যার ত্বরণ বন্ধ থাকলে, কিংবা গ্রাফিক্সের ড্রাইভার খুব পুরোনো হলে তা বন্ধ হয়ে থাকতে পারে। হার্ডওয়্যার ত্বরণ চালু করুন, কিংবা অন্য একটি ব্রাউজার দিয়ে দেখুন।
কিছু কি আপলোড হয়?
না। সিমুলেশনটি আপনার নিজের ব্রাউজারই WebGL দিয়ে আঁকে; কিছুই কোথাও পাঠানো হয় না, আর পাতাটি একবার লোড হয়ে গেলে তা অফলাইনেও চলতে থাকে।