জেল তড়িৎচলন কীভাবে কাজ করে আর একটি DNA জেল কীভাবে পড়বেন

DNA-কে কী চালায়

DNA-র প্রতিটি নিউক্লিওটাইডই তার ফসফেটে একটি ঋণাত্মক আধান বয়, তাই একটি তড়িৎক্ষেত্রে DNA ধনাত্মক তড়িৎদ্বারের (লালটির; মনে রাখুন “লালের দিকে ছোটে”) দিকে চলে। মুক্ত দ্রবণে আধান আর ঘর্ষণ দুটিই দৈর্ঘ্যের সঙ্গে তাল মিলিয়ে বাড়ে, তাই একটি 100 bp টুকরো আর একটি 10,000 bp টুকরো একই বেগে চলত। জেলই সেগুলো আলাদা করে: অ্যাগারোজ ছিদ্রের একটি জালে জমে যায়, আর লম্বা অণু তার ভেতর দিয়ে এঁকেবেঁকে চলতে গিয়ে বেশি পিছিয়ে পড়ে।

একটি ব্যান্ড কোথায় গিয়ে দাঁড়ায় তা কী ঠিক করে

• টুকরোর দৈর্ঘ্য। একটি জেলের কাজের পরিসরে চলা দূরত্বটি দৈর্ঘ্যের লগারিদমের সঙ্গে মোটামুটি একটি সরলরেখায় নামে। মাপ দ্বিগুণ করলে ওই পরিসরের যেকোনো জায়গাতেই একটি ব্যান্ড প্রায় একই দূরত্বই পিছিয়ে যায়।
• অ্যাগারোজের শতকরা। একটি ঘন জেলের ছিদ্র ছোট। মোটামুটি: 5 থেকে 20 kb-তে 0.7%, 0.5 থেকে 10 kb-তে 1%, 0.2 থেকে 3 kb-তে 1.5%, 50 bp থেকে 1 kb-তে 2 থেকে 3%।
• ক্ষেত্রের জোর। বেগ সমানুপাতী তড়িৎদ্বারের মাঝে প্রতি সেন্টিমিটারে বিভবের সঙ্গে, বিভবটির সঙ্গে নয়। 5 থেকে 8 V/cm-ই চলতি; 15 cm দূরে তড়িৎদ্বারওয়ালা একটি ট্যাংকে একটি মিনি জেল প্রায় 100 V-তে চলে।
• আকার। অতিকুণ্ডলিত প্লাজমিড ঠাসা আর তা একই দৈর্ঘ্যের সরলরেখা DNA-র আগে চলে; খোঁচা-লাগা (খোলা বৃত্ত) প্লাজমিড টেনে পিছিয়ে পড়ে; RNA আর এক-সূত্রক ভাঁজ হয়ে যায় আর তা কতদূর চলবে বলা যায় না।
• বাফার আর রং। TAE বড় টুকরো একটু ভালো আলাদা করে, TBE ছোটগুলো। ইথিডিয়াম ব্রোমাইড DNA-কে একটু ধীর করে, আর ভরার রং এমন মাপের টুকরোর সঙ্গে চলে যা জেলের ওপরে নির্ভর করে: 1% অ্যাগারোজে ব্রোমোফেনল নীল প্রায় 300 থেকে 500 bp-র সঙ্গে, জাইলিন সায়ানল প্রায় 3 থেকে 4 kb-র সঙ্গে।

মাপনী থেকে একটি ব্যান্ডের মাপ বের করা

একটি মাপনী হলো জানা মাপের টুকরোর একটি মিশেল, যা তার নিজের লেনে চলে। কুয়ো থেকে প্রতিটি মাপনীর ব্যান্ড পর্যন্ত দূরত্ব মাপুন, দূরত্বের বিপরীতে log₁₀(মাপ) আঁকুন আর একটি সরলরেখা বসান: সেটিই আদর্শ বাঁক। একটি অজানা ব্যান্ডের মাপ ওই রেখা থেকেই পড়ে নিন।

কষে দেখানো উদাহরণ: একটি 1% জেলে 3,000 bp মাপনীর ব্যান্ডটি 2.6 cm চলেছে আর 1,000 bp-র ব্যান্ডটি 4.0 cm। তাদের ভেতর দিয়ে যাওয়া রেখাটির ঢাল (log₁₀ 1,000 − log₁₀ 3,000) ÷ (4.0 − 2.6) = −0.477 ÷ 1.4 = প্রতি cm-এ −0.341। 3.3 cm-এ একটি অজানা ব্যান্ড আছে log₁₀(মাপ) = log₁₀ 3,000 − 0.341 × 0.7 = 3.477 − 0.239 = 3.238-এ, তাই তার মাপ 10^3.238 ≈ 1,730 bp। অজানাটির দুপাশের দুটি মাপনীর ব্যান্ড নিন, কিংবা কয়েকটির ভেতর দিয়ে বসানো একটি রেখা, আর শেষ মাপনীর ব্যান্ড পেরিয়ে কিছু পড়ে নেবেন না।

চেনা ফল পড়া

• না-কাটা প্লাজমিড: দুটি বা তিনটি ব্যান্ড, সবচেয়ে নিচে অতিকুণ্ডলিত, সবচেয়ে ওপরে খোঁচা-লাগা, কখনো মাঝে সরলরেখাটি। একটি সরলরেখার মাপনীতে তাদের একটিও প্লাজমিডের আসল মাপে বসে না।
• সরলরেখা করা প্লাজমিড (একটি কাটা): পুরো দৈর্ঘ্যে একটি ব্যান্ড, যা একটিমাত্র এনজাইম কেটেছে তা পরখ করার একটি ভালো উপায়।
• জোড়া কাটা: যে টুকরোগুলো যোগ করে প্লাজমিডের মাপ হওয়ার কথা। না হলে একটি ছোট টুকরো জেল থেকে বেরিয়ে যেতে পারে কিংবা দেখার মতো বেশি হালকা হতে পারে, কিংবা একই রকম মাপের দুটি টুকরো একটিই ব্যান্ডে বসে থাকতে পারে।
• PCR উৎপাদ: আশা করা মাপে একটি তীক্ষ্ণ ব্যান্ড। একটি দাগ মানে বেশি টেমপ্লেট কিংবা বেশি চক্র; বাড়তি ব্যান্ড মানে প্রাইমার ভুল জায়গায় জোড়া বাঁধছে; তলার দিকে একটি ঝাপসা ব্যান্ড মানে প্রাইমার ডাইমার।

সিমুলেশনটি ব্যবহার করা

জেল তড়িৎচলনের সিমুলেটর-এ 1 থেকে 6 লেনে আছে একটি মাপনী, একটি না-কাটা প্লাজমিড, একবার ও দুবার কাটা প্লাজমিডটি, একটি PCR উৎপাদ আর আপনি যে মাপগুলো লেখেন। চলাটি সঙ্গে সঙ্গেই শুরু হয়। ব্রোমোফেনল নীলের সামনের ধারটি নিচের দিকে প্রায় তিন-চতুর্থাংশ পথ গেলে থামিয়ে দিন, তারপর ছবির নিচে মাপগুলো পড়ে নিন, যার প্রত্যেকটি জেলে তখনো থাকা মাপনীর ব্যান্ডগুলোতে বসানো একটি রেখা থেকে আন্দাজ করা। দেখে নেওয়ার মতো কিছু:

• 6 লেনে 100, 150, 200 বসিয়ে একটি 1% জেল চালান: তিনটিই কাছাকাছি চলে, ঠিক রঙের সামনের ধারের আগে। 2.5%-এ আবার চালান আর সেগুলো আলাদা হয়ে যায়।
• 1% অ্যাগারোজে 6 লেনে 20000, 30000, 48000 বসান: সেগুলো একটিই ব্যান্ডে জমে যায়, অর্থাৎ সীমায় বাঁধা চলনে।
• বিভবটি 250 V-তে ঘুরিয়ে দিন: চলাটি দ্রুত, কিন্তু জেল গরম হওয়ার সঙ্গে ব্যান্ড ঝাপসা হয়ে যায় আর মাঝের লেন ধারের লেনের আগে চলে যায় (হাসা)।
• চলাটি চলতে দিন: ছোট টুকরো আর রংটি প্রান্ত পেরিয়ে বেরিয়ে গিয়ে হারিয়ে যায়।

আদলটি যা ধরে নেয়

• একটি অভিজ্ঞতা-ভিত্তিক চলনের সূত্র, μ = μ₀ ÷ (1 + (L ÷ L*)^0.9), যেখানে L* = 2,000 bp × (1% ÷ T)^1.4, আর তা TAE-তে 0.5 থেকে 3% অ্যাগারোজে বাস্তব অবস্থান দিতেই বেছে নেওয়া। তা একটি বসানো ফিট, ছিদ্রের ভেতর দিয়ে DNA কীভাবে চলে তার একটি তত্ত্ব নয়, আর তার সংখ্যাগুলো চলতি, কোনো ব্র্যান্ডের অ্যাগারোজে নির্দিষ্ট নয়।
• খুব লম্বা DNA-র জন্য সীমায় বাঁধা একটি চলন, যার নিচে কোনো টুকরোই আর ধীর হয় না; 1% অ্যাগারোজে তা প্রায় 20 kb-তে পৌঁছায়।
• প্লাজমিডের জন্য বাঁধা আকারের গুণক: অতিকুণ্ডলিত DNA চলে তার দৈর্ঘ্যের 0.6 গুণ সরলরেখা DNA-র মতো, খোঁচা-লাগা 1.8 গুণের মতো। সত্যিই গুণকগুলো জেলের শতকরা, বিভব, কতটা অতিকুণ্ডলন আর জেলে ইথিডিয়াম ব্রোমাইড আছে কি না তার সঙ্গে বদলায়।
• একটি কাটায় প্রতিটি টুকরোর সমান পরিমাণ (সমমোলার), তাই ব্যান্ডের উজ্জ্বলতা দৈর্ঘ্যের সমানুপাতী, আর নমুনার প্রতিটি লেনে 300 ng DNA। একটি ব্যান্ড দেখা দিতে প্রায় 2 ng লাগে।
• জেল জুড়ে একটি সমান ক্ষেত্র আর তাপমাত্রা, তড়িৎদ্বারের মাঝে 15 cm আর 1.6 kΩ বাফারের রোধ, কেবল 10 V/cm-র ওপরে গরম হওয়ার একটি সরল দণ্ড ছাড়া।
• ব্যাপনে ব্যান্ডের চওড়া আর তার সঙ্গে কুয়োর চওড়া; বেশি ভরা, নমুনায় লবণ আর অসমান কুয়ো, যা সবই আসল ব্যান্ড বিকৃত করে, তা বাইরে রাখা হয়েছে।

কিনারার বেলা

• মাপনীর বাইরের টুকরো একটি প্রশ্নচিহ্ন পায়: রেখাটি তার তথ্য পেরিয়ে বাইরে বাড়িয়ে নেওয়া আর তা খুব বেঠিক হতে পারে।
• প্রায় একই মাপের দুটি টুকরো একটিই ব্যান্ড হয়ে চলে, দ্বিগুণ উজ্জ্বল। কেবল উজ্জ্বলতাই তা ফাঁস করে দেয়; একটি লম্বা চলা কিংবা একটি ঘন জেল সেগুলো ভাগ করে দিতে পারে।
• খুব ছোট টুকরো (1% অ্যাগারোজে প্রায় 100 bp-র নিচে) রঙের সামনের ধারের সঙ্গেই চলে আর তার আড়ালে পড়ে যায়, আর প্রায় 2 ng-র নিচের খুব হালকা ব্যান্ড কখনোই দেখা দেয় না।
• একটি জোড়া কাটায় প্লাজমিডের চেয়ে লম্বা একটি টুকরো অসম্ভব; কাটার দূরত্ব প্লাজমিড যতটা চলতে দেয় তার চেয়ে বড় বসালে সিমুলেশনটি তা বেঁধে দেয়।
• প্রান্ত পেরিয়ে চলা: রংটি জেল ছাড়ার অল্প পরেই চলাটি থেমে যায়, আর যে ব্যান্ডগুলো বেরিয়ে গেছে তাদের মাপ আর বের করা যায় না।

আদলটি কোথায় আর ঠিক থাকে না

• প্রায় 20 থেকে 50 kb-র ওপরে DNA সরীসৃপের মতো চলে, প্রান্ত আগে দিয়ে এঁকেবেঁকে, আর সব লম্বা টুকরোই একসঙ্গে চলে। সেগুলো আলাদা করতে দরকার স্পন্দিত-ক্ষেত্রের জেল তড়িৎচলন, যা আদলটি বর্ণনা করতে পারে না।
• পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেল একটিমাত্র বেসে আলাদা টুকরোও আলাদা করে, যেমন সিকোয়েন্সিংয়ে; অ্যাগারোজ তা পারে না, আর সূত্রটি সেগুলোতে খাটে না।
• প্রোটিন আলাদা করা হয় SDS-PAGE জেলে, একটি আলাদা কলকাঠিতে (SDS তাদের দৈর্ঘ্যের সমানুপাতে একটি আধানে ঢেকে দেয়); সেগুলোর জন্য SDS-PAGE জেলের হিসাব ব্যবহার করুন।
• এক-সূত্রক DNA আর RNA এমন আকারে ভাঁজ হয় যা তাদের বেগ বদলে দেয়; মাপ ধরে চলতে সেগুলোর বিকৃতকারী জেল দরকার।
• আসল জেল সমান নয়: অসমান গরম হওয়া, একটি ঢালু জেল, একটি লেনে লবণ কিংবা বেশি DNA — সবই ব্যান্ড এমনভাবে বাঁকিয়ে আর ঘেঁটে দেয় যা একজন পাঠক চিনতে শেখেন আর একটি আদল দেখায় না।

হিসাব

অ্যাগারোজ জেলের হিসাব (আর তার পথনির্দেশ, একটি অ্যাগারোজ জেল কীভাবে বানাবেন) দিয়ে জেলটি ঢালুন, আপনার নিজের মাপ থেকে জেলের ব্যান্ডের মাপের আন্দাজ দিয়ে ব্যান্ডের মাপ বের করুন, আর রেস্ট্রিকশন ম্যাপ দিয়ে একটি কাটার টুকরোগুলো আগেই বলে দিন।