Cara Kerja Elektroforesis Gel dan Cara Membaca Gel DNA

Apa yang menggerakkan DNA

Setiap nukleotida DNA membawa satu muatan negatif pada fosfatnya, jadi dalam medan listrik DNA bergerak ke elektroda positif (yang merah; ingat "lari ke merah"). Dalam larutan bebas, muatan dan gesekan bertambah bersamaan dengan panjang, sehingga fragmen 100 bp dan fragmen 10.000 bp akan bergerak sama cepat. Yang memisahkannya adalah gel: agarosa membentuk jaring berpori, dan molekul yang lebih panjang lebih tertahan saat menerobosnya.

Apa yang menentukan letak sebuah pita

• Panjang fragmen. Dalam rentang yang berguna pada suatu gel, jarak tempuh turun kira-kira lurus terhadap logaritma panjang. Menggandakan ukuran memundurkan pita kira-kira sejauh yang sama di mana pun dalam rentang itu.
• Persentase agarosa. Gel yang lebih pekat memiliki pori lebih kecil. Kira-kira: 0,7% untuk 5 sampai 20 kb, 1% untuk 0,5 sampai 10 kb, 1,5% untuk 0,2 sampai 3 kb, 2 sampai 3% untuk 50 bp sampai 1 kb.
• Kuat medan. Kecepatan sebanding dengan volt per sentimeter di antara elektroda, bukan dengan tegangan itu sendiri. Lazimnya 5 sampai 8 V/cm; gel mini di tangki dengan elektroda berjarak 15 cm dijalankan pada sekitar 100 V.
• Bentuk. Plasmid superkoil itu ringkas dan bergerak mendahului DNA linear yang sama panjang; plasmid yang satu untainya putus (lingkaran terbuka) terseret dan tertinggal; RNA dan untai tunggal melipat dan bergerak tak terduga.
• Bufer dan pewarna. TAE sedikit lebih baik memisahkan fragmen besar, TBE fragmen kecil. Etidium bromida sedikit memperlambat DNA, dan pewarna pemuat bergerak bersama fragmen berukuran tertentu yang bergantung pada gel: biru bromofenol bersama sekitar 300 sampai 500 bp pada agarosa 1%, xilena sianol bersama sekitar 3 sampai 4 kb.

Mengukur pita dengan penanda

Penanda adalah campuran fragmen berukuran diketahui yang dijalankan di lajurnya sendiri. Ukur jarak dari sumur ke setiap pita penanda, plot log₁₀(ukuran) terhadap jarak, lalu tarik garis lurus: kurva standar. Baca ukuran pita yang tak diketahui dari garis itu.

Contoh: pada gel 1%, pita penanda 3.000 bp menempuh 2,6 cm dan pita 1.000 bp 4,0 cm. Garis melalui keduanya memiliki kemiringan (log₁₀ 1.000 − log₁₀ 3.000) ÷ (4,0 − 2,6) = −0,477 ÷ 1,4 = −0,341 per cm. Pita tak diketahui pada 3,3 cm berada pada log₁₀(ukuran) = log₁₀ 3.000 − 0,341 × 0,7 = 3,477 − 0,239 = 3,238, jadi ukurannya 10^3,238 ≈ 1.730 bp. Pakai dua pita penanda yang mengapit pita tak diketahui, atau garis yang disesuaikan dengan beberapa pita, dan jangan membaca melewati pita penanda terakhir.

Membaca hasil yang umum

• Plasmid yang belum dipotong: dua atau tiga pita, superkoil paling bawah, yang satu untainya putus paling atas, dan kadang yang linear di antaranya. Tidak ada yang berada pada ukuran plasmid sebenarnya menurut penanda linear.
• Plasmid yang dilinearkan (satu potongan): satu pita pada panjang penuh, bukti yang baik bahwa satu enzim telah memotong.
• Digesti ganda: fragmen yang seharusnya berjumlah sama dengan ukuran plasmid. Bila tidak, mungkin fragmen kecil sudah keluar dari gel atau terlalu redup, atau dua fragmen berukuran mirip berada dalam satu pita.
• Produk PCR: satu pita tajam pada ukuran yang diharapkan. Pita yang mengolesi berarti cetakan terlalu banyak atau siklus terlalu banyak; pita tambahan, primer menempel di tempat yang salah; pita kabur di paling bawah, dimer primer.

Memakai simulasi

Di Simulator Elektroforesis Gel, lajur 1 sampai 6 berisi penanda, plasmid yang belum dipotong, plasmid yang dipotong sekali dan dua kali, produk PCR, dan ukuran yang kamu ketik. Elektroforesis langsung dimulai. Hentikan ketika garis depan biru bromofenol sudah menempuh sekitar tiga perempat jalan, lalu baca ukurannya di bawah gambar, masing-masing ditaksir dari garis yang disesuaikan dengan pita penanda yang masih ada di gel. Yang bisa dicoba:

• Isi lajur 6 dengan 100, 150, 200 dan jalankan gel 1%: ketiganya bergerak berdekatan, tepat di depan garis depan pewarna. Ulangi pada 2,5% dan ketiganya terpisah.
• Isi lajur 6 dengan 20000, 30000, 48000 pada agarosa 1%: ketiganya menumpuk dalam satu pita, yaitu mobilitas batas.
• Naikkan tegangan ke 250 V: elektroforesis cepat, tetapi pita menjadi kabur dan lajur tengah mendahului lajur tepi (tersenyum) karena gel memanas.
• Biarkan elektroforesis berlanjut: fragmen kecil dan pewarna keluar dari ujung gel dan hilang.

Apa yang diasumsikan model

• Rumus mobilitas empiris, μ = μ₀ ÷ (1 + (L ÷ L*)^0,9) dengan L* = 2.000 bp × (1% ÷ T)^1,4, dipilih agar memberi posisi yang realistis untuk agarosa 0,5 sampai 3% dalam TAE. Ini hasil penyesuaian, bukan teori tentang bagaimana DNA bergerak melalui pori, dan angkanya khas, bukan tepat untuk merek agarosa tertentu.
• Mobilitas batas untuk DNA yang sangat panjang, sehingga tidak ada fragmen yang melambat lebih dari itu; pada agarosa 1% batas ini tercapai sekitar 20 kb.
• Faktor bentuk yang tetap untuk plasmid: DNA superkoil bergerak seperti DNA linear sepanjang 0,6 kali panjangnya, yang satu untainya putus seperti 1,8 kali. Kenyataannya faktor ini berubah menurut persentase gel, tegangan, tingkat superkoil, dan ada tidaknya etidium bromida dalam gel.
• Jumlah tiap fragmen sama dalam digesti (ekuimolar), sehingga kecerahan pita sebanding dengan panjangnya, dan 300 ng DNA per lajur sampel. Sebuah pita perlu sekitar 2 ng agar terlihat.
• Medan dan suhu yang seragam di seluruh gel, 15 cm di antara elektroda, dan hambatan bufer 1,6 kΩ, kecuali penalti pemanasan sederhana di atas 10 V/cm.
• Lebar pita dari difusi ditambah lebar sumur; kelebihan muatan, garam dalam sampel, dan sumur yang tidak rata, yang mengubah bentuk pita sungguhan, tidak dimasukkan.

Kasus batas

• Fragmen di luar rentang penanda diberi tanda tanya: garisnya diperpanjang melewati datanya dan bisa jauh meleset.
• Dua fragmen yang hampir sama ukurannya bergerak sebagai satu pita, dua kali lebih terang. Hanya kecerahannya yang membocorkan; elektroforesis yang lebih lama atau gel yang lebih pekat bisa memisahkannya.
• Fragmen yang sangat kecil (di bawah sekitar 100 bp pada agarosa 1%) bergerak bersama garis depan pewarna dan tertutup olehnya, dan pita yang sangat redup di bawah sekitar 2 ng tidak pernah tampak.
• Fragmen yang lebih panjang dari plasmid mustahil dalam digesti ganda; bila jarak potong diatur lebih besar daripada yang dimungkinkan plasmid, simulasi membatasinya.
• Melewati ujung gel: tak lama setelah pewarna keluar dari gel, elektroforesis berhenti, dan pita yang sudah keluar tidak bisa diukur.

Di mana model tidak lagi berlaku

• Di atas sekitar 20 sampai 50 kb DNA bergerak secara reptasi, meliuk dengan satu ujung di depan, dan semua fragmen panjang bergerak bersama. Memisahkannya memerlukan elektroforesis gel medan berdenyut, yang tidak bisa digambarkan model ini.
• Gel poliakrilamida memisahkan fragmen yang berbeda satu basa, seperti pada sekuensing; agarosa tidak bisa, dan rumusnya tidak berlaku untuk gel itu.
• Protein dipisahkan pada gel SDS-PAGE, dengan mekanisme lain (SDS menyelubunginya dengan muatan yang sebanding dengan panjang); untuk itu pakai Kalkulator Gel SDS-PAGE.
• DNA untai tunggal dan RNA melipat menjadi bentuk yang mengubah kecepatannya; keduanya perlu gel denaturasi agar bergerak menurut ukuran.
• Gel sungguhan tidak seragam: pemanasan tidak merata, gel yang miring, garam, atau DNA terlalu banyak dalam satu lajur membengkokkan dan mengoleskan pita dengan cara yang dipelajari pembaca gel dan tidak ditampilkan model.

Kalkulator

Buat gel dengan Kalkulator Gel Agarosa (dan panduannya, Cara Membuat Gel Agarosa), ukur pita dari pengukuranmu sendiri dengan Penaksir Ukuran Pita Gel, dan prediksi fragmen sebuah digesti dengan Peta Restriksi.