जेल वैद्युतकणसंचलन कैसे काम करता है और DNA जेल कैसे पढ़ें

DNA को क्या चलाता है

DNA के हर न्यूक्लियोटाइड के फ़ॉस्फ़ेट पर एक ऋण आवेश होता है, इसलिए विद्युत क्षेत्र में DNA धन इलेक्ट्रोड (लाल वाले) की ओर चलता है; याद रखें, "लाल की ओर दौड़"। मुक्त विलयन में आवेश और घर्षण दोनों लंबाई के साथ बराबर बढ़ते हैं, इसलिए 100 bp और 10,000 bp का खंड एक ही चाल से चलते। उन्हें जेल अलग करता है: एगरोज़ छिद्रों की जाली बनाता है, और लंबे अणु उसमें से गुज़रते समय ज़्यादा रुकते हैं।

बैंड कहाँ रुकेगा, यह क्या तय करता है

• खंड की लंबाई। जेल के उपयोगी दायरे में तय की गई दूरी लंबाई के लघुगणक के साथ लगभग सीधी रेखा में घटती है। आकार दोगुना करने पर उस दायरे में कहीं भी बैंड लगभग उतनी ही दूरी पीछे रह जाता है।
• एगरोज़ प्रतिशत। सघन जेल के छिद्र छोटे होते हैं। मोटे तौर पर: 5 से 20 kb के लिए 0.7%, 0.5 से 10 kb के लिए 1%, 0.2 से 3 kb के लिए 1.5%, 50 bp से 1 kb के लिए 2 से 3%।
• क्षेत्र की प्रबलता। चाल इलेक्ट्रोडों के बीच प्रति सेंटीमीटर वोल्ट के समानुपाती होती है, वोल्टेज के नहीं। आम तौर पर 5 से 8 V/cm; 15 cm की दूरी पर इलेक्ट्रोड वाले टैंक में मिनी जेल लगभग 100 V पर चलता है।
• आकृति। सुपरकॉइल्ड प्लाज़्मिड सघन होता है और उसी लंबाई के रैखिक DNA से आगे चलता है; निक्ड (खुला वृत्त) प्लाज़्मिड घिसटता है और पीछे रहता है; RNA और एकल रज्जुक मुड़ जाते हैं और अप्रत्याशित ढंग से चलते हैं।
• बफ़र और डाई। TAE बड़े खंडों को थोड़ा बेहतर अलग करता है, TBE छोटे खंडों को। एथिडियम ब्रोमाइड DNA को थोड़ा धीमा करता है, और लोडिंग डाई उस आकार के खंडों के साथ चलती हैं जो जेल पर निर्भर है: 1% एगरोज़ में ब्रोमोफ़िनॉल ब्लू लगभग 300 से 500 bp के साथ, ज़ाइलीन सायनॉल लगभग 3 से 4 kb के साथ।

लैडर से बैंड का आकार निकालना

लैडर ज्ञात आकार के खंडों का मिश्रण है जो अपनी लेन में चलता है। कुएँ से हर लैडर बैंड तक की दूरी मापें, log₁₀(आकार) को दूरी के सापेक्ष आलेखित करें और एक सीधी रेखा फ़िट करें: मानक वक्र। अज्ञात बैंड का आकार उस रेखा से पढ़ें।

उदाहरण: 1% जेल में 3,000 bp का लैडर बैंड 2.6 cm और 1,000 bp का बैंड 4.0 cm चला। दोनों से गुज़रती रेखा का ढाल (log₁₀ 1,000 − log₁₀ 3,000) ÷ (4.0 − 2.6) = −0.477 ÷ 1.4 = −0.341 प्रति cm है। 3.3 cm पर एक अज्ञात बैंड log₁₀(आकार) = log₁₀ 3,000 − 0.341 × 0.7 = 3.477 − 0.239 = 3.238 पर है, तो उसका आकार 10^3.238 ≈ 1,730 bp है। अज्ञात बैंड के दोनों ओर के लैडर बैंड इस्तेमाल करें, या कई बैंड पर फ़िट की गई रेखा, और आख़िरी लैडर बैंड के आगे न पढ़ें।

आम नतीजे पढ़ना

• बिना कटा प्लाज़्मिड: दो या तीन बैंड, सुपरकॉइल्ड सबसे नीचे, निक्ड सबसे ऊपर और कभी-कभी रैखिक बीच में। रैखिक लैडर पर इनमें से कोई प्लाज़्मिड के असली आकार पर नहीं होता।
• रैखिक किया प्लाज़्मिड (एक कट): पूरी लंबाई पर एक बैंड, यह अच्छा सबूत कि एक एंज़ाइम ने काटा।
• दोहरा डाइजेस्ट: ऐसे खंड जिनका योग प्लाज़्मिड के आकार के बराबर होना चाहिए। न हो तो शायद कोई छोटा खंड जेल से बाहर निकल गया या बहुत धुंधला है, या मिलते-जुलते आकार के दो खंड एक ही बैंड में हैं।
• PCR उत्पाद: अपेक्षित आकार पर एक तीखा बैंड। धब्बा यानी बहुत ज़्यादा टेम्पलेट या बहुत ज़्यादा चक्र; अतिरिक्त बैंड यानी प्राइमर ग़लत जगहों पर जुड़ रहे हैं; सबसे नीचे धुंधला बैंड यानी प्राइमर डाइमर।

सिम्युलेशन का उपयोग

जेल वैद्युतकणसंचलन सिम्युलेटर में लेन 1 से 6 में लैडर, बिना कटा प्लाज़्मिड, एक और दो बार कटा प्लाज़्मिड, PCR उत्पाद और आपके टाइप किए आकार हैं। रन तुरंत शुरू होता है। जब ब्रोमोफ़िनॉल ब्लू का अग्रभाग लगभग तीन-चौथाई रास्ता तय कर ले तब रोकें, फिर चित्र के नीचे आकार पढ़ें, हर एक का अनुमान अभी जेल पर मौजूद लैडर बैंड पर फ़िट की गई रेखा से लगाया जाता है। आज़माने लायक:

• लेन 6 में 100, 150, 200 डालें और 1% जेल चलाएँ: तीनों साथ-साथ चलते हैं, डाई अग्रभाग से ज़रा आगे। 2.5% पर दोहराएँ और वे अलग हो जाते हैं।
• 1% एगरोज़ में लेन 6 में 20000, 30000, 48000 डालें: वे एक बैंड में जमा हो जाते हैं, यही सीमांत गतिशीलता है।
• वोल्टेज 250 V करें: रन तेज़ है, पर बैंड धुंधले हो जाते हैं और जेल गर्म होने से बीच की लेन किनारों से आगे निकलती हैं (मुस्कान)।
• रन चलने दें: छोटे खंड और डाई सिरे से बाहर निकलकर खो जाते हैं।

मॉडल क्या मानकर चलता है

• एक अनुभवजन्य गतिशीलता सूत्र, μ = μ₀ ÷ (1 + (L ÷ L*)^0.9), जहाँ L* = 2,000 bp × (1% ÷ T)^1.4, जिसे TAE में 0.5 से 3% एगरोज़ के लिए यथार्थवादी स्थितियाँ देने के लिए चुना गया है। यह एक फ़िट है, छिद्रों से DNA के चलने का सिद्धांत नहीं, और इसकी संख्याएँ सामान्य हैं, किसी ख़ास एगरोज़ ब्रांड के लिए सटीक नहीं।
• बहुत लंबे DNA के लिए सीमांत गतिशीलता, जिसके नीचे कोई खंड और धीमा नहीं होता; 1% एगरोज़ में यह लगभग 20 kb पर पहुँचती है।
• प्लाज़्मिड के लिए तय आकृति गुणक: सुपरकॉइल्ड DNA अपनी लंबाई के 0.6 गुना वाले रैखिक DNA की तरह चलता है, निक्ड 1.8 गुना वाले की तरह। असल में ये गुणक जेल प्रतिशत, वोल्टेज, सुपरकॉइलिंग की मात्रा और जेल में एथिडियम ब्रोमाइड होने से बदलते हैं।
• डाइजेस्ट में हर खंड की बराबर मात्रा (समआणविक), इसलिए बैंड की चमक लंबाई के समानुपाती होती है, और हर नमूना लेन में 300 ng DNA। दिखने के लिए बैंड को लगभग 2 ng चाहिए।
• पूरे जेल में समान क्षेत्र और तापमान, इलेक्ट्रोडों के बीच 15 cm और बफ़र का प्रतिरोध 1.6 kΩ, बस 10 V/cm से ऊपर एक सरल तापन दंड।
• विसरण से बैंड की चौड़ाई और कुएँ की चौड़ाई; ज़रूरत से ज़्यादा नमूना, नमूने में नमक और असमान कुएँ, जो असली बैंड बिगाड़ते हैं, शामिल नहीं।

सीमांत स्थितियाँ

• लैडर के दायरे से बाहर के खंडों पर प्रश्नचिह्न लगता है: रेखा अपने आँकड़ों से आगे बढ़ाई जाती है और बहुत ग़लत हो सकती है।
• लगभग एक जैसे आकार के दो खंड एक ही बैंड के रूप में चलते हैं, दोगुनी चमक के साथ। केवल चमक से पता चलता है; लंबा रन या सघन जेल उन्हें अलग कर सकता है।
• बहुत छोटे खंड (1% एगरोज़ में लगभग 100 bp से कम) डाई अग्रभाग के साथ चलते हैं और उसके नीचे छिप जाते हैं, और लगभग 2 ng से कम के बहुत धुंधले बैंड कभी नहीं दिखते।
• प्लाज़्मिड से लंबा खंड दोहरे डाइजेस्ट में असंभव है; अगर कट की दूरी प्लाज़्मिड की अनुमति से ज़्यादा रखी जाए तो सिम्युलेशन उसे सीमित कर देता है।
• सिरे से आगे निकलना: डाई के जेल से निकलने के थोड़ी देर बाद रन रुक जाता है, और बाहर निकल चुके बैंड का आकार नहीं निकाला जा सकता।

मॉडल कहाँ सही नहीं रहता

• लगभग 20 से 50 kb से ऊपर DNA रेप्टेशन से चलता है, एक सिरा आगे करके साँप की तरह, और सभी लंबे खंड साथ चलते हैं। उन्हें अलग करने के लिए पल्स्ड-फ़ील्ड जेल वैद्युतकणसंचलन चाहिए, जिसे यह मॉडल नहीं बता सकता।
• पॉलीएक्रिलामाइड जेल एक ही क्षारक से अलग खंडों को अलग करते हैं, जैसे अनुक्रमण में; एगरोज़ ऐसा नहीं कर सकता, और सूत्र उन पर लागू नहीं होता।
• प्रोटीन SDS-PAGE जेल में अलग किए जाते हैं, दूसरी क्रियाविधि से (SDS उन पर लंबाई के समानुपाती आवेश चढ़ा देता है); उनके लिए SDS-PAGE जेल कैलकुलेटर इस्तेमाल करें।
• एकल-रज्जुक DNA और RNA ऐसी आकृतियों में मुड़ते हैं जो उनकी चाल बदल देती हैं; आकार के अनुसार चलाने के लिए उन्हें विकृतिकारी जेल चाहिए।
• असली जेल समान नहीं होते: असमान तापन, झुका जेल, नमक या किसी लेन में बहुत ज़्यादा DNA बैंड को ऐसे मोड़ते और फैलाते हैं जिसे जेल पढ़ने वाला पहचानना सीखता है और मॉडल नहीं दिखाता।

कैलकुलेटर

एगरोज़ जेल कैलकुलेटर से जेल बनाएँ (और उसकी गाइड, एगरोज़ जेल कैसे बनाएँ), अपने मापों से बैंड का आकार जेल बैंड नाप अनुमानक से निकालें, और किसी डाइजेस्ट के खंडों का अनुमान रेस्ट्रिक्शन मैप से लगाएँ।